CNSH. Huỳnh Yến Vy – IVFMD Phú Nhuận – Bệnh viện Mỹ Đức Phú Nhuận
 
Sự ra đời của tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (Intracytoplasmic sperm injection- ICSI) là một phương pháp hiệu quả trong việc khắc phục tình trạng vô sinh do yếu tố ở nam giới, tuy nhiên vẫn có đến 1 – 3% chu kỳ ICSI thất bại thụ tinh hoàn toàn (total failed fertilization - TFF). Thất bại thụ tinh (fertilization failure - FF) có nhiều nguyên nhân, trong đó có liên quan đến hàm lượng protein phospholipase C zeta (PLCζ) không có, giảm hoặc bất thường trong tinh trùng. Protein PLCζ, được công nhận là yếu tố hoạt hóa noãn sinh ra từ đầu tinh trùng, có nhiệm vụ tạo ra những dao động ion canxi (Ca²⁺ ) trong noãn sau khi tinh trùng xâm nhập vào noãn hoặc tiêm tinh trùng vào tế bào chất của noãn. Những dao động Ca²⁺ này rất cần thiết cho nhiều quá trình để hoàn tất quá trình thụ tinh, bao gồm ngăn ngừa đa tinh trùng, kết thúc của giảm phân và hình thành hai tiền nhân. Hiện nay, khoảng 30 biến thể PLCZ1 khác nhau đã được xác định ở những trường hợp thất bại thụ tinh hoàn toàn do yếu tố nam giới hoặc tỉ lệ thụ tinh thấp sau ICSI. Nhiều nghiên cứu báo cáo rằng, các biến thể được tìm thấy PLCZ1 dạng đồng hợp tử hoặc dị hợp tử. Một số nghiên cứu gần đây phát hiện các biến thể protein giống actin 7A (ACTL7A) và 9 (ACTL9) cũng có liên quan đến tình trạng FF và sự ngưng phát triển của phôi sau ICSI. Cả ACTL7A và ACTL9 đều đóng vai trò trong quá trình hình thành và hợp nhất các túi có nguồn gốc từ Golgi trong quá trình sinh tổng hợp acrosome. Các protein này được phân bố nằm ở lớp dưới acrosome của lớp vỏ tế bào (perinuclear theca - PT) của đầu tinh trùng, có vai trò quan trọng để duy trì sự gắn kết của acrosome với màng nhân. Các khiếm khuyết trong ACTL7A hoặc ACTL9 có thể dẫn đến tách rời acrosome, làm lớp vỏ PT mở rộng điều này gây ra rối loạn vị trí và hàm lượng PLCζ, là nguyên nhân giải thích cho việc tỷ lệ thụ tinh thấp được quan sát thấy ở những bệnh nhân này. Cho đến hiện nay, có chín biến thể ACTL7A khác và ba biến thể ACTL9 đã được báo cáo ở những bệnh nhân mắc FF sau ICSI. Việc áp dụng hoạt hóa noãn nhân tạo (assisted oocyte activation - AOA) bằng ion Ca²⁺ trong ICSI đã được chứng minh là có thể khắc phục vấn đề thụ tinh để đạt được khả năng sinh con sống hiệu quả cao ở những bệnh nhân mắc FF sau ICSI. Đối với những bệnh nhân có biến thể PLCZ1 khi kết hợp hỗ trợ hoạt hóa noãn giúp giải quyết tình trạng thiếu giải phóng Ca²⁺. Tuy nhiên, cho đến hiện tại vẫn chưa có nghiên cứu về việc tinh trùng từ những bệnh nhân có biến thể ACTL7A và ACTL9 trong những chu kì có sử dụng AOA thì những tinh trùng này có kích hoạt giải phóng Ca²⁺ trong quá trình thụ tinh hay không.
 
Mục đích: Đánh giá các biến thể PLCZ1, ACTL7A và ACTL9 của một nhóm bệnh nhân sau khi thất bại thụ tinh sau ICSI thông qua hàm lượng protein PLCζ, mô hình dao động Ca²⁺ sau khi tiêm tinh trùng của bệnh nhân vào noãn chuột.
 
Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực hiện trên 55 bệnh nhân từ năm 2006 đến năm 2023, chia thành hai nhóm bệnh nhân:

• Nhóm 1: 28 bệnh nhân chỉ trải qua sàng lọc di truyền PLCZ1
• Nhóm 2: 27 bệnh nhân trải qua sàng lọc di truyền PLCZ1, ACTL7A và ACTL9

Các bệnh nhân trãi qua ít nhất một chu kì ICSI với ít nhất 4 noãn trưởng thành (Metaphase II – MII) với tỉ lệ thụ tinh trung bình ≤ 33,33%. Bệnh nhân đã trãi qua thử nghiệm hoạt hóa noãn chuột và ít nhất một chu kì ICSI -AOA bằng cách tiêm canxi clorua (CaCl₂ ) và tiếp xúc với ionomycin với nồng độ gấp đôi. Bệnh nhân hiến tặng một mẫu tinh trùng và một mẫu nước bọt để xét nghiệm di truyền sàng lọc các biến thể.
Tiêu chí loại trừ bao gồm vô sinh do yếu tố nam giới với mật độ tinh trùng < 0,1 triệu/mL hoặc tinh trùng đầu tròn (globozoospermia). Độ tuổi trung bình của mẹ là 33,06 ± 4,26 tuổi trong chu kỳ ICSI cuối cùng và 34,62 ± 4,07 trong chu kỳ ICSI-AOA cuối cùng.
 
Kết quả:
- Sàng lọc di truyền các gen PLCZ1, ACTL7A và ACTL9 ở bệnh nhân nam thất bại thụ tinh sau ICSI (tỷ lệ thụ tinh trung bình = 14,61%) cho thấy 29,09% (16/55) bệnh nhân mang ít nhất một biến thể trong PLCZ1, 14,81% (4/27) trong ACTL7A và 3,70% (1/27) trong ACTL9. Trong đó, có 7 biến thể PLCZ1 khác nhau (p.Ile74Thr, p.Gln94*, p.Arg141His, p.His233Leu, p.Lys322*, p.Ile379Thr và p.Ser500Leu), 5 biến thể khác nhau (p.Tyr183His, p.Gly214Ser, p.Val340Met, p.Ser364Glnfs*9, p.Arg373Cys) được tìm thấy trong ACTL7A một biến thể được tìm thấy trong ACTL9 (p.Arg271Pro).
- Khi phân tích hàm lượng canxi giải phóng đối với noãn chuột (Mouse oocyte Ca2+ analysis - MOCA) và noãn người (human oocyte Ca2+ analysis – HOCA) sau khi được tiêm tinh trùng, kết quả cho thấy sự giải phóng Ca2+ bất thường hoặc không có trong quá trình thụ tinh ở tất cả bệnh nhân ngoại trừ một bệnh nhân, bao gồm cả những bệnh nhân có biến thể dị hợp PLCZ1 và ACTL7A so với mẫu đối chứng.
- Khi phân tích tác động của các biến thể lên vị trí và biểu hiện protein PLCζ thông qua nhuộm miễn dịch huỳnh quang và đánh giá thông qua kính hiển vi điện tử truyền qua (transmission electron microscopy – TEM) cho thấy cấu trúc siêu vi acrosome bất thường ở bệnh nhân có biến thể ACTL7A, nhưng chỉ những bệnh nhân có biến thể ACTL7A đồng hợp tử mới cho thấy cường độ huỳnh quang giảm so với nhóm đối chứng.
- Trong những chu kì thực hiện hoạt hóa noãn nhân tạo (assisted oocyte activation - AOA) bằng ionomycin đối với những bệnh nhân có biến thể PLCZ1 và ACTL7A, Tỷ lệ thụ tinh được cải thiện từ 11,24% trong 47 chu kỳ ICSI thông thường lên 61,80% trong 35 chu kỳ ICSI–AOA ( P <0,0001). Tỷ lệ β-hCG dương tính mỗi chu kỳ tăng từ 10,64% sau ICSI lên 60,00% sau ICSI–AOA ( P < 0,0001), trong khi tỷ lệ sinh con sống mỗi chu kỳ tăng từ 6,38% sau ICSI lên 37,14% sau ICSI–AOA ( P = 0,0007). Đặc biệt, bốn ca sinh sống và hai ca mang thai diễn tiến được tạo ra bằng tinh trùng từ những bệnh nhân có biến thể ACTL7A.
 
Kết luận: Sàng lọc di truyền đối với những gen PLCZ1, ACTL7A và ACTL9 là một xét nghiệm chẩn đoán giúp đơn giãn hóa trong việc chẩn đoán với tình trạng thụ tinh thất bại hoàn toàn hoặc tỷ lệ thụ tinh thấp sau ICSI, loại bỏ nhu cầu về các xét nghiệm chẩn đoán phức tạp như phân tích hàm lượng canxi giải phóng đối với noãn chuột - MOAT hoặc HOCA hoặc phân tích hàm lượng Ca²⁺. Các biến thể PLCZ1 dị hợp tử đủ để gây ra sự giải phóng Ca²⁺ không đủ trong quá trình ICSI. Để giải quyết tình trạng thiếu hụt Ca²⁺, hỗ trợ hoạt hóa noãn nhân tạo – AOA được áp dụng bằng cách tiêm CaCl₂ tiếp theo là tiếp xúc với ionomycin giúp cải thiện tỉ lệ thụ tinh cũng như kết quả lâm sàng đối với nhóm bệnh nhân này, bao gồm cả bệnh nhân có biến thể ACTL7A , những nhóm bệnh nhân có biểu hiện tình trạng thiếu hụt giải phóng Ca²⁺.
 
Tài liệu tham khảo: Cardona Barberán, A., Reddy Guggilla, R., Colenbier, C., Van der Velden, E., Rybouchkin, A., Stoop, D., ... & Heindryckx, B. (2024). High rate of detected variants in male PLCZ1 and ACTL7A genes causing failed fertilization after ICSI. Human Reproduction Open, 2024(4), hoae057. https://doi.org/10.1093/hropen/hoae057

Từ khóa: vô sinh nam, thất bại thụ tinh sau ICSI, biến thể PLCZ1, biến thể ACTL7A , hỗ trợ hoạt hóa noãn nhân tạo