Hội Nội tiết sinh sản và Vô sinh TPHCM
HOSREM - Ho Chi Minh City Society for Reproductive Medicine

Tin tức
on Thursday 13-03-2025 2:21pm
Viết bởi: Khoa Pham
Danh mục: Tin quốc tế
CNSH. Trầm Uyển Vy
 
Giới thiệu
Theo Hiệp hội Sinh sản và Phôi học châu Âu (European Society of Human Reproduction and Embryology – ESHRE), tỷ lệ thai lâm sàng trên mỗi chu kỳ chuyển phôi là khoảng 34%. Ở thời điểm hiện tại, công nghệ hỗ trợ sinh sản vẫn chưa đạt hiệu quả cao. Nguyên nhân là do tình trạng lệch bội ở phôi, cụ thể là mất cân bằng nhiễm sắc thể (NST) đồ liên quan đến thêm/mất từ 1 NST trở lên. Lệch bội trong giảm phân là do lỗi phân chia NST trong quá trình sản sinh giao tử, dẫn đến phôi bào bất thường về NST. Ngược lại, lệch bội trong nguyên phân là do lỗi phân chia tế bào ở giai đoạn sau hợp tử, hình thành phôi chứa phôi bào nguyên bội và lệch bội, gọi là phôi khảm.
Xét nghiệm di truyền tiền làm tổ sàng lọc lệch bội NST (Preimplantation genetic testing for aneuploidy – PGT-A) giúp phát hiện bất thường NST ở phôi sau khi thực hiện IVF. Phôi lệch bội đồng nhất không được chọn để chuyển do thất bại làm tổ, sảy thai và bất thường bẩm sinh. Ngược lại, phôi khảm có thể có quá trình phát triển bình thường và có thể sinh ra em bé khoẻ mạnh.
Xem xét 2 giả thuyết, một là phôi khảm có khả năng tự sửa chữa thông qua con đường chết theo chương trình tế bào một cách chọn lọc và giảm tăng sinh tế bào lệch bội. Nghiên cứu cho thấy lệch bội dẫn đến mất điều hoà gen và tăng sinh tế bào, chết theo chương trình tế bào, tự thực. Giả thuyết còn lại là sau khi sinh thiết tế bào lá nuôi phôi (trophectoderm – TE), kết quả phôi khảm chỉ dựa trên số lượng bản sao NST, dẫn đến hiện tượng dương tính giả. Nghiên cứu khác cho thấy hầu hết kết quả phôi khảm được dựa trên một mẫu TE sinh thiết. Ngoài ra, kết quả này không thể phân biệt với yếu tố nhiễu do kỹ thuật, dẫn đến mức độ ưu tiên chuyển phôi khảm giảm. Do đó, kết quả chuyển phôi khảm bị ảnh hưởng do chẩn đoán sai bản chất phôi nguyên bội, lệch bội và sai lệch đối với bệnh nhân có tiên lượng xấu.
Nghiên cứu thực hiện kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (Immunofluorescence – IF) và quan sát hình ảnh đồng tiêu nhằm so sánh tỷ lệ chết theo chương trình tế bào dựa trên dòng tế bào chuyên biệt, bao gồm phôi nguyên bội, khảm, lệch bội bằng nền tảng PGT-A tích hợp số lượng bản sao và phân tích dữ liệu đa hình đơn nucleotide (Single nucleotide polymorphism – SNP). Sự biểu hiện khác nhau của các marker chết theo chương trình tế bào ở phôi khảm giúp giải thích ảnh hưởng của lệch bội trong nguyên phân đến khả năng sống sót của phôi.
 
Phương pháp nghiên cứu
Đây là nghiên cứu đoàn hệ tiến cứu. Tổng số 64 phôi nang được thực hiện PGT-A vào ngày 5 hoặc ngày 6 sau thụ tinh (Day post-fertilization – dpf). Độ tuổi trung bình của bệnh nhân hiến noãn, tinh trùng là 34,8 ± 6,3 và 38,3 ± 7,4. Chỉ định thực hiện PGT-A bao gồm phụ nữ lớn tuổi, sảy thai liên tiếp, thất bại làm tổ liên tiếp và sàng lọc lệch bội.
Nghiên cứu được chia thành 2 giai đoạn. Giai đoạn đầu, phân tích biểu hiện của marker chết theo chương trình tế bào, caspase-3 hoạt động/phân cắt trên 53 phôi: 13 phôi nguyên bội (11 ngày 5, 2 ngày 6), 22 phôi khảm (16 ngày 5, 6 ngày 6), 18 phôi lệch bội (11 ngày 5, 7 ngày 6). Giai đoạn sau, phân tích mức độ phân mảnh DNA - biểu hiện chết theo chương trình tế bào với kỹ thuật đánh dấu đứt gãy DNA bằng dUTP (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labelling – TUNEL) trên 11 phôi: 2 phôi nguyên bội (1 ngày 5, 1 ngày 6), 5 phôi khảm (4 ngày 5, 1 ngày 6), 4 phôi ngày 5 lệch bội.
Quy trình IVF
Chọc hút noãn được thực hiện 36 giờ sau khi trigger. Thực hiện tách noãn ngay trước khi tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (Intracytoplasmic sperm injection – ICSI), 4 giờ sau chọc hút noãn. Noãn sau khi ICSI được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy Gems (37℃, 6% CO2, 5% O2) đến giai đoạn phôi nang. Đánh giá chất lượng phôi theo hướng dẫn từ Hiệp hội Nghiên cứu Sinh học Sinh sản Tây Ban Nha (ASEBIR).
PGT-A
Phôi ngày 3 được hỗ trợ thoát màng với công nghệ laser. Điều kiện sinh thiết phôi nang là từ giai đoạn phôi nang hoàn toàn trở về sau với khối tế bào bên trong (Inner cell mass – ICM) rõ ràng và lớp TE dính chặt.
Mẫu TE sinh thiết được đánh dấu, lưu trữ ở -20℃ và chuyển đến phòng thí nghiệm (PTN) phân tích di truyền. Phôi nang sau sinh thiết được tiếp tục nuôi cấy và trữ lạnh theo quy trình của Kitazato.
Phương pháp thực hiện PGT-A là PGTseq dựa trên công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (Next-generation sequencing – NGS). Vật liệu di truyền của tế bào TE sinh thiết được trích xuất, khuếch đại và giải trình tự. Phôi khảm được xác định khi biến thể số lượng bản sao trong khoảng từ 30% đến 70%. Ngoài ra, thực hiện song song với kỹ thuật phân tích SNP trên mỗi lần sinh thiết.
Cố định phôi và miễn dịch huỳnh quang
Rã đông phôi theo quy trình của Kitazato và nuôi cấy đến khi phôi nở rộng trở lại (2-4 giờ). Rửa phôi (PBS, 2 phút) - cố định phôi (PBS + paraformaldehyde 4%, 20 phút) ở nhiệt độ phòng (Room temperature – RT) - rửa phôi 2 lần (PBS + Tween-20 0,1%; 2 phút) - thấm phôi (PBS + Triton X-100 0,5%; 30 phút; RT) - rửa phôi 3 lần (PBS + Tween-20 0,1% + BSA 2%; 2 phút) - ủ phôi (buffer, PBS + BSA 5%, 4 giờ, 4℃). Ủ kháng thể sơ cấp (buffer, qua đêm, 4℃): anti-NANOG, anti-GATA3, anti-caspase-3 (hoạt động/phân cắt). Ủ kháng thể thứ cấp (buffer, 1 giờ, RT): Alexa Fluor 647, 568, 488. Ngoài ra, nhuộm phôi với 165 µM DAPI, 15 phút, RT để biểu hiện nhân.
Nhuộm TUNEL: ủ phôi (12 µl hỗn hợp phản ứng TUNEL, 1 giờ, 37℃) trong điều kiện ẩm sau khi ủ với kháng thể thứ cấp.
Quan sát hình ảnh đồng tiêu
Đặt phôi đã nhuộm vào đáy đĩa thuỷ tinh có các giọt chứa 15 µl PBS với BSA 2%, phủ bằng dầu khoáng. Quan sát dưới kính hiển vi đồng tiêu FV1000 với phần mềm FV10-ASW 4.2b.
Đồng định vị dòng tế bào và marker chết theo chương trình tế bào
Phân tích số lượng các loại tế bào trên mỗi phôi nang: tất cả tế bào (DAPI+), tế bào TE (GATA3+), tế bào ICM (GATA3-/NANOG+), tế bào chết theo chương trình (caspase-3+). Đánh giá các mặt phẳng vuông góc riêng lẻ nhằm xác nhận sự đồng định vị của các marker tế bào.
Phân tích thống kê
Ngưỡng khác biệt có ý nghĩa thống kê khi P < 0,05.
 
Kết quả
Sau khi nhuộm miễn dịch huỳnh quang phát hiện marker DAPI, NANOG, GATA3 trên 64 phôi nang, kết quả cho thấy 3387 tế bào DAPI+, 1138 tế bào NANOG+, 2693 tế bào GATA3+.
Nhuộm caspase-3 trên 53/64 phôi nang, cho thấy 912 tế bào caspase-3+. Còn lại 11 phôi nang được nhuộm TUNEL cho thấy 124 tế bào TUNEL+.
Giai đoạn 1: Nhuộm caspase-3
Tổng số lượng tế bào
Tổng số lượng phôi bào ngày 5 và ngày 6, tổng số lượng tế bào của phôi nguyên bội, khảm, lệch bội ngày 5 và ngày 6 không có sự khác biệt.

Phân tích biểu hiện NANOG và GATA3
Tỷ lệ tế bào NANOG+, GATA3+/NANOG+ giảm từ ngày 5 đến ngày 6. Ngược lại, tỷ lệ tế bào GATA3+ tăng từ ngày 5 đến ngày 6.
Phôi lệch bội có tỷ lệ tế bào GATA3+ không tăng đáng kể từ ngày 5 đến ngày 6.
Tỷ lệ tế bào GATA3+/NANOG+: ngày 5 lệch bội > khảm, nguyên bội; ngày 6 lệch bội, khảm > nguyên bội.
Tỷ lệ tế bào GATA3+/NANOG+: lệch bội không thể sống sót > nguyên bội, khảm có thể sống sót; khảm không thể sống sót < lệch bội; khảm có thể, không thể sống sót = lệch bội không thể sống sót.

Định lượng tế bào TE, ICM
Số lượng tế bào GATA3+ (TE): ngày 6 > ngày 5.
Số lượng tế bào GATA3-/NANOG+ (ICM): ngày 6 = ngày 5.
Số lượng tế bào GATA3+, GATA3-/NANOG+: ngày 5, ngày 6 nguyên bội = ngày 5, ngày 6 khảm, lệch bội.

Phân tích biểu hiện caspase-3 của tế bào TE
Tỷ lệ chết theo chương trình tế bào: 39% (901/2310).
Tỷ lệ tế bào caspase-3+ ở phôi ngày 5: khảm, lệch bội > nguyên bội; tỷ lệ tế bào caspase-3+ ở phôi ngày 6: nguyên bội, khảm, lệch bội tương tự nhau.
Tỷ lệ tế bào caspase-3+: nguyên bội < lệch bội không thể sống sót; phôi khảm không thể sống sót gần như cao hơn đáng kể so với phôi nguyên bội.
Phân tích biểu hiện caspase-3 của tế bào ICM
Tỷ lệ chết theo chương trình tế bào: 1,9% (11/596).
Tỷ lệ tế bào caspase-3+: nguyên bội (0%), khảm (6,9%), lệch bội (5,8%).
Giai đoạn 2: Kỹ thuật TUNEL
Tỷ lệ tế bào ICM TUNEL+: 0% (0/98); tỷ lệ tế bào TE TUNEL+: 32,4% (124/383).
Cụ thể, tỷ lệ phân mảnh DNA của tế bào TE ở phôi nguyên bội, khảm và lệch bội không có sự khác biệt đáng kể.
 
Kết luận
Nghiên cứu cung cấp bằng chứng liên quan đến sự tương quan giữa các thay đổi về chức năng tế bào và lệch bội đồng nhất/khảm ở phôi nang. Đồng thời, nghiên cứu giúp giải thích nguyên nhân dẫn đến thất bại trong quá trình phát triển của hầu hết phôi lệch bội và cơ chế đồng bộ ở phôi khảm giúp loại bỏ các tế bào lệch bội. Từ đó, đặc tính sinh học của phôi khảm được hiểu rõ và cung cấp thông tin quan trọng về yếu tố xác định tiềm năng sinh sản của chúng.
 
Nguồn: Martín A, Mercader A, Beltrán D và cộng sự. Trophectoderm cells of human mosaic embryos display increased apoptotic levels and impaired differentiation capacity: a molecular clue regarding their reproductive fate? Human Reproduction. 2024 Feb 2.

Các tin khác cùng chuyên mục:
TIN CẬP NHẬT
TIN CHUYÊN NGÀNH
LỊCH HỘI NGHỊ MỚI
Năm 2020

Vinpearl Landmark 81, ngày 9-10 tháng 8 năm 2025

Năm 2020

Chủ nhật ngày 20 . 07 . 2025, Caravelle Hotel Saigon (Số 19 - 23 Công ...

Năm 2020

Caravelle Hotel Saigon, thứ bảy 19 . 7 . 2025

GIỚI THIỆU SÁCH MỚI

Kính mời quý đồng nghiệp quan tâm đến hỗ trợ sinh sản tham ...

Y học sinh sản số 73 (Quý I . 2025) ra mắt ngày 20 . 3 . 2025 và ...

Sách ra mắt ngày 6 . 1 . 2025 và gửi đến quý hội viên trước ...

Hội viên liên kết Bạch kim 2024
Hội viên liên kết Vàng 2024
Hội viên liên kết Bạc 2024
FACEBOOK