CNSH. Huỳnh Ngọc Uyên – IVFMD Phú Nhuận, Bệnh viện Mỹ Đức Phú Nhuận
 
Vô tinh không do tắc nghẽn (non-obstructive azoospermia – NOA) là dạng vô sinh nam nghiêm trọng liên quan đến khiếm khuyết trong quá trình sản xuất tinh trùng. Hiện tại phương pháp điều trị thu nhận tinh trùng cho những trường hợp NOA là phẫu thuật trích tinh trùng với tỷ lệ thành công khoảng 50%. Đối với những trường hợp NOA không tìm thấy tinh trùng sau phẫu thuật, người ta tìm thấy có các tế bào gốc sinh tinh (spermatogonial stem cells – SSCs) chiếm đến 74,7%. Bên cạnh đó, để bảo tồn khả năng sinh sản với những bé trai sau khi điều trị ung thư có sử dụng các liệu pháp gây độc tuyến sinh dục người ta đã tiến hành trữ mẫu mô tinh hoàn. Tuy nhiên, đến nay vẫn chưa có công nghệ nào có thể tái tạo khả năng sản xuất tinh trùng từ tế bào gốc sinh tinh sau điều trị ung thư hoặc NOA nguyên phát. Vì vậy việc phát triển các phương pháp có khả năng tái tạo tinh trùng thông qua quá trình sinh tinh in vitro là cần thiết. Giải pháp chính là việc phát triển công nghệ tái tạo tinh trùng thông qua in 3-D sinh học, phương pháp này có thể xây dựng cấu trúc tế bào phức tạp bằng vật liệu sinh học dựa trên thiết kế máy tính, nhằm tái tạo liên kết giữa tế bào mầm và tế bào soma trong tế bào tinh hoàn. Mô hình này đã được ứng dụng thành công trên động vật nhưng chưa được ứng dụng trên người. Vì vậy nghiên cứu này được thực hiện với với mục tiêu: Nghiên cứu tính khả thi và khả năng sinh tinh của tế bào tinh hoàn của bệnh nhân mắc NOA bằng phương pháp in 3-D sinh học.
 
Phương pháp thực hiện
Mẫu sinh thiết tinh hoàn được thu nhận từ 1 bệnh nhân nam 31 tuổi, bị vô tinh không do tắc hiến tặng. Tiến hành phân lập các tế bào tinh hoàn và nuôi cấy in vitro, sau đó làm nguyên liệu để in 3-D sinh học thành các cấu trúc hình ống giống ống sinh tinh thông qua sử mực sinh học AGC10™ và máy in sinh học RX1™ với đầu in vi lỏng đồng trục CENTRA™ từ Aspect Biosystems™. Cụm 3-D organoid được sử dụng như mẫu đối chứng trong nghiên cứu này. Sau đó tiến hành đánh giá khả năng sống sót của các tế bào sau khi in 3-D sinh học sau 24 giờ bằng cách sử dụng Bộ công cụ LIVE/DEAD™ với phần mềm ImageJ. Tiếp theo tiến hành khảo sát sự hiện diện của các dấu hiệu kiểu hình và mức độ biểu hiện của các dấu ấn gen chức năng sinh tinh sau 12 ngày nuôi cấy in vitro bằng phương pháp RT-qPCR.
 
Kết quả RT-qPCR được biểu thị dưới dạng giá trị Định lượng tương đối (RQ=2^-ΔΔCt) và giá trị Delta Ct, mẫu có giá trị Ct ≤ 40 chu kỳ được xem là mẫu âm tính. Giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct) được chuẩn hóa thành Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase (GAPDH).
 
Kết quả nghiên cứu

• Kết quả nuôi cấy tạo ra mật độ tế bào cho in 3-D sinh học là 35x10⁶ tế bào/mL mực in sinh học, tỷ lệ sống sau 24 giờ là 93,4±2,4%.
• Các tế bào sau 12 ngày nuôi cấy dương tính với các dấu hiệu kiểu hình: gene SOX9, INSL3, ACTA2, SYCP3 đã chứng minh sự có mặt của tế bào Sertoli, Leydig, tế bào myoid phúc mạc ở đáy của ống sinh tinh và sự giảm phân tế bào mầm.
• Mức độ biểu hiện của các dấu ấn gene chức năng trong mẫu in 3-D sinh học tăng so với đối chứng. Qua đó cho thấy sự cải thiện đặc biệt đáng kể ở các gene liên quan đến việc duy trì tế bào gốc sinh tinh: ID4 tăng biểu hiện 365 lần; FGFR3 tăng biểu hiện 94.152 lần; KIT giảm biểu hiện 2 lần và STRA8 tăng biểu hiện 125 lần, cụm organoid (KIT: giảm  biểu hiện 11 lần, STRA8: tăng biểu hiện 3 lần). Mức độ biểu hiện của DAZL tăng ở cả bản in (114 lần) và organoid (9 lần).
• Cả bản in và organoid đối chứng đều tăng biểu hiện SYCP3 (bản in: tăng 7 lần, organoids: tăng 2 lần), TNP1 (bản in: tăng 2908 lần, organoid: tăng 1870 lần), PRM2 (bản in: tăng 11 lần, organoid: tăng 99 lần), ZPBP chỉ tăng biểu hiện ở bản in (tăng 2 lần).
• Mức độ biểu hiện của SYCP3, TNP1, PRM2 đều tăng lần lượt ở cả bản in (7 lần, 2908 lần, 11 lần) và ở organoid (2 lần, 1870 lần, 99 lần). ZPBP chỉ tăng biểu hiện ở bản in (tăng 2 lần).

 
Kết luận
Nghiên cứu này lần đầu tiên chứng minh tính khả thi của việc in 3D sinh học sử dụng tế bào tinh hoàn người trưởng thành. Tế bào tinh hoàn từ 1 bệnh nhân có thể được in sinh học tạo các tế bào với khả năng sống cao và không làm mất các chức năng của mô tinh hoàn. Kết quả nghiên cứu này mở ra tiềm năng cho công nghệ in 3D sinh học mô tinh hoàn người, tái tạo quá trình sinh tinh và làm cơ sở cho y học tái tạo trong tương lai.
 
Nguồn: Robinson, M., Bedford, E., Witherspoon, L., Willerth, S. M., & Flannigan, R. (2022). Using clinically derived human tissue to 3-dimensionally bioprint personalized testicular tubules for in vitro culturing: first report. F&S Science, 3(2), 130-139.

Từ khóa: In sinh học, sự sinh tinh, người, khả năng sinh sản, coaxial.