CN. Trần Thị Hoa Phượng – IVF Tâm Anh

Giới thiệu
Noãn đóng vai trò then chốt trong quá trình sinh sản hữu tính ở động vật có vú. Chất lượng của quá trình trưởng thành noãn có ý nghĩa then chốt đối với sự thành công của thụ tinh và khả năng phát triển của phôi ở giai đoạn sớm. Các bào quan như ty thể và bộ máy Golgi, đảm nhiệm các chức năng chuyên biệt, đều mang vai trò thiết yếu cho quá trình giảm phân và thụ tinh của noãn ở động vật có vú. Ty thể chịu trách nhiệm chính trong việc sản xuất ATP thông qua hô hấp tế bào. Bên cạnh đó, ty thể còn đóng một vai trò quan trọng trong việc sản xuất và loại bỏ các gốc tự do (reactive oxygen species - ROS), vốn là sản phẩm phụ của quá trình sản xuất ATP. Mức độ ROS bất thường sẽ dẫn đến stress oxy hóa, một tình trạng mất cân bằng giữa quá trình sản xuất và loại bỏ ROS. Trong quá trình lão hóa, chất lượng noãn suy giảm đi kèm với rối loạn chức năng bào quan và stress oxy hóa, dẫn đến vô sinh. AMP-activated protein kinase (AMPK) là một protein kinase serine/threonine, đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cân bằng nội môi năng lượng và quá trình trao đổi chất. AMPK được kích hoạt khi mức năng lượng tế bào giảm. Mặc dù AMPK đã được nghiên cứu trong nhiều mô hình khác nhau, nhưng hiểu biết về mối liên hệ tiềm năng giữa AMPK với quá trình lão hóa của noãn vẫn còn hạn chế.

Nghiên cứu của Hu và cộng sự (2024) tập trung vào việc tìm hiểu mối liên hệ giữa mức độ AMPK và sự suy giảm chất lượng noãn trong quá trình lão hóa sau rụng trứng, cũng như các cơ chế tiềm năng liên quan. Hu và cộng sự đã báo cáo rằng mức độ AMPK bị thay đổi trong quá trình lão hóa và việc ức chế hoạt động của AMPK đã gây ra các khiếm khuyết trong quá trình trưởng thành của noãn chuột. Phân tích sâu hơn nhóm tác giả thấy rằng, tương tự như chất điều hòa ngược của nó là PKD1, AMPK có khả năng giảm mức ROS để ngăn ngừa stress oxy hóa trong noãn. Cơ chế này có thể liên quan đến sự điều hòa chức năng ty thể, vì việc mất hoạt động AMPK đã gây ra sự phân bố bất thường, giảm sản xuất ATP và giảm số lượng bản sao mtDNA của ty thể. Ngoài ra, nhóm tác giả cũng quan sát thấy sự phân bố bất thường của lưới nội chất (endoplasmic reticulum - ER) và bộ máy Golgi sau khi ức chế AMPK, đồng thời chức năng lysosome cũng được tăng cường. Vì vậy, nghiên cứu này nhằm làm sáng tỏ vai trò quan trọng của AMPK trong chức năng bào quan và việc giảm stress oxy hóa trong quá trình trưởng thành giảm phân của noãn.
 
Vật liệu và phương pháp
Nghiên cứu này đã được phê duyệt bởi Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật của Đại học Nông nghiệp Nam Kinh và tuân theo các hướng dẫn liên quan. Noãn chuột ICR cái 5-6 tuần tuổi được thu thập và nuôi cấy trong môi trường M16 ở điều kiện thích hợp. Để gây lão hóa sau rụng trứng, noãn được nuôi cấy thêm 12 giờ sau 12 giờ nuôi cấy ban đầu. Để phát hiện ROS, ty thể, ER, bộ máy Golgi và lysosome được thực hiện bằng cách ủ noãn sống với các thuốc nhuộm huỳnh quang và sau đó nhuộm DNA bằng Hoechst. Các mẫu noãn sau đó được quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét laser đồng tiêu. Quy trình Western blotting sử dụng khoảng 150-200 noãn được ly giải và làm nóng ở 100°C trong 10 phút, sau đó điện di SDS-PAGE và chuyển lên màng PVDF (Millipore). Màng được ủ với kháng thể sơ cấp (AMPK 1:1000, β-actin 1:4000, GAPDH 1:2000) ở 4°C trong ít nhất 8 giờ, tiếp theo là kháng thể thứ cấp (1:2000) trong 1 giờ. Protein được phát hiện bằng thuốc thử phát quang hóa và ghi nhận bằng Tanon-3900. Để phát hiện ROS, 30 noãn chuột được ủ với 10 pM DCFH-DA trong 30 phút và kiểm tra bằng kính hiển vi quét laser đồng tiêu (Zeiss LSM 900). Để đo hàm lượng ATP, 30 noãn được ly giải bằng thuốc thử ATP,  sau đó đo giá trị phát quang sau khi trộn với hỗn hợp xét nghiệm ATP. Để xác định số lượng bản sao mtDNA, 50 noãn được tách DNA và phân tích bằng phản ứng PCR realtime với các mồi đặc hiệu cho mtDNA và β-actin. Các đoạn mồi được sử dụng như sau: mồi mtDNA: F, 5′- CCA ATA CGC CCT TTA ACA AC -3′; R, 5′- GCT AGT GTG AGT GAT AGG GTAG − 3′; mồi β-actin: F, 5′- TGT GAC GTT GAC ATC CGT AA -3′; R, 5′- GCT AGG AGC CAG AGC AGT AA-3′. Để phân tích cường độ huỳnh quang, các mẫu noãn được gắn và quét với cùng thông số rồi đo bằng phần mềm Image J, đặc biệt ở vùng ngoại vi thoi vô sắc giai đoạn MI. Phân tích thống kê được thực hiện trên ít nhất 3 lần lặp lại với ≥ 30 noãn mỗi thí nghiệm, sử dụng GraphPad Prism 5.0 và t - test, với p < 0,05.
 
Kết quả
AMPK được biểu hiện ổn định ở cả giai đoạn kỳ giữa I và kỳ giữa II trong quá trình giảm phân của noãn chuột (1 so với 1,17 ± 0,22). Dữ liệu nhuộm huỳnh quang cho thấy rằng trong quá trình giảm phân I của noãn, AMPK phân bố đồng đều trong tế bào chất từ giai đoạn túi mầm (GV). Tuy nhiên, nhóm tác giả nhận thấy rằng trong quá trình lão hóa sau rụng trứng, sự biểu hiện của AMPK giảm ở giai đoạn kỳ giữa II (1 so với 0,64 ± 0,17, p < 0,05). Dữ liệu nhuộm huỳnh quang cũng cho ra cùng kết quả khi cho thấy tín hiệu yếu hơn trong tế bào chất. Phát hiện này cũng được xác minh bằng dữ liệu phân tích cường độ huỳnh quang (1 so với 0,58 ± 0,09, p < 0,05). Những dữ liệu này cho thấy rằng AMPK tồn tại trong noãn và mức độ của nó bị thay đổi trong quá trình lão hóa của noãn. Dữ liệu của nhóm tác giả cho thấy rằng sau 12 giờ nuôi cấy, noãn tươi có hình thái bình thường, tuy nhiên, ở noãn lão hóa có tỷ lệ phân mảnh lớn, trong khi việc bổ sung COM C vào noãn lão hóa cho thấy tỷ lệ phân mảnh cao hơn (7,87 ± 3,67% đối với noãn đối chứng; 37,4 ± 10,7% đối với noãn lão hóa; 51,8 ± 17,8% đối với noãn lão hóa + COM C). Việc mất hoạt động AMPK đã gây ra sự thất bại trong việc đẩy thể cực thứ nhất. Tỷ lệ đẩy thể cực thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng (65,00 ± 1,73% so với 52,73 ± 2,16%, p < 0,05). Để khám phá vai trò của AMPK, nghiên cứu đã kiểm tra mức ROS và nhận thấy rằng trong nhóm đối chứng có rất ít noãn có tín hiệu ROS đáng kể sau 12 giờ nuôi cấy, trong khi đó, một tỷ lệ lớn noãn ở nhóm AMPK bị ức chế (bằng COM C) lại cho thấy tín hiệu ROS mạnh hơn (25,30 ± 1,6 so với 18,15 ± 1,2, p < 0,001). Hơn nữa, việc ức chế PKD1, một chất điều hòa ngược dòng của AMPK, đã làm tăng lượng ROS trong noãn chuột (1 so với 1,68 ± 0,27 so với 3,09 ± 0,24, p < 0,05). Những dữ liệu này cho thấy AMPK rất cần thiết cho việc duy trì mức ROS trong quá trình trưởng thành của noãn. AMPK đóng vai trò quan trọng trong chức năng ty thể của noãn chuột, giúp ngăn ngừa stress oxy hóa qua việc điều chỉnh động lực học của ty thể. Ức chế AMPK gây ra phân bố bất thường của ty thể, với tỷ lệ bất thường tăng từ 30,2 ± 4,86% lên 69,2 ± 5,26% (p < 0,05). Nó cũng làm giảm sản xuất ATP (1 so với 0,47 ± 0,11, p < 0,05) và số lượng bản sao mtDNA (1 so với 0,66 ± 0,08, p < 0,05). Những dữ liệu này chứng minh AMPK cần thiết cho sự phân bố và chức năng của ty thể trong quá trình trưởng thành của noãn. AMPK rất cần thiết cho sự phân bố ER và Golgi trong noãn chuột. Ức chế AMPK phá vỡ sự phân bố ER ở vùng ngoại vi thoi vô sắc (56171 ± 635,9 so với 21015 ± 1227, p < 0,001) và làm giảm tích tụ Golgi ở vùng này (1 so với 0,42 ± 0,10, p < 0,01). Ngoài ra, ức chế AMPK tăng tín hiệu lysosome trong tế bào chất (1 so với 3,97 ± 1,1, p < 0,01). Những dữ liệu này chứng minh vai trò quan trọng của AMPK trong duy trì hoạt động của các bào quan trong quá trình trưởng thành noãn.
 
Bàn luận
AMPK là chất điều hòa trao đổi chất quan trọng, liên quan đến ty thể và nhiều quá trình tế bào khác. Nghiên cứu chỉ ra rằng sự biểu hiện AMPK giảm ở noãn lão hóa, gây tăng ROS, làm rối loạn chức năng ty thể, ER và Golgi, dẫn đến các khiếm khuyết trưởng thành noãn. Ức chế AMPK làm tăng bất thường phân bố ty thể (69,2% so với 30,2%, p < 0,05), giảm ATP (1 so với 0,47 ± 0,11, p < 0,05), mtDNA (1 so với 0,66 ± 0,08, p < 0,05), phá vỡ phân bố ER (56171 ± 635,9 so với 21015 ± 1227, p < 0,001), và Golgi (1 so với 0,42 ± 0,10, p < 0,01). Stress oxy hóa qua ROS, tăng lysosome (1 so với 3,97 ± 1,1, p < 0,01), và chức năng bất thường bào quan đều có thể liên quan đến vai trò của AMPK. AMPK có thể điều chỉnh ty thể để ngăn stress oxy hóa và hỗ trợ chức năng ER, Golgi, trong khi mất hoạt động AMPK liên quan đến phân mảnh noãn và giảm chất lượng. Những phát hiện này củng cố vai trò AMPK trong kiểm soát stress oxy hóa, tự thực bào và chức năng bào quan trong lão hóa.
 
Kết luận
Tóm lại, nghiên cứu của Hu và cộng sự (2024) cho thấy rằng AMPK được biểu hiện trong noãn chuột và có liên quan đến quá trình lão hóa của noãn. AMPK có thể ảnh hưởng đến chức năng ty thể để kiểm soát stress oxy hóa và duy trì chức năng bào quan ER/Golgi trong noãn chuột.
 
Hu, L. L., Liao, M. H., Liu, Y. X., Xing, C. H., Nong, L. L., Yang, F. L., & Sun, S. C. (2024). Loss of AMPK activity induces organelle dysfunction and oxidative stress during oocyte aging. Biology Direct, 19(1), 29.

Từ khóa: AMPK, lysosome, rối loạn chức năng bào quan ở tế bào noãn