CNSH. Lê Thị Quỳnh – IVFMD SIH- Bệnh viện Phụ sản Quốc tế Sài Gòn
 
TỔNG QUAN
Suy buồng trứng sớm (Premature ovarian insufficiency - POI) đặc trưng bởi sự mất chức năng buồng trứng trước tuổi 40. Tỷ lệ mắc POI là từ 1% đến 3,5% dân số trên toàn thế giới. Liệu pháp thay thế hormone (Hormonal replacement therapy - HRT) có thể giảm thiểu các triệu chứng thiếu hụt estrogen và giảm nguy cơ tim mạch liên quan đến mãn kinh sớm. Tuy nhiên, đối với những bệnh nhân (BN) trong độ tuổi sinh sản vẫn đang mong muốn có thêm con thì các lựa chọn rất hạn chế.
 
Các nang nguyên thủy còn sót lại trong buồng trứng của bệnh nhân POI đã mãn kinh vẫn ở trạng thái ngủ đông. Quá trình điều hòa hoạt hóa nang nguyên thủy liên quan đến một số cơ chế phức tạp bao gồm con đường phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)–protein kinase B (Akt). Trong mô hình chuột, việc mất gen tensin (PTEN) đặc hiệu của noãn - một chất điều hòa âm tính quan trọng của tín hiệu PI3K–Akt, dẫn đến kích hoạt toàn bộ nhóm nang nguyên thủy. Điều này chứng minh vai trò quan trọng của con đường PI3K–Akt trong việc duy trì trạng thái ngủ của nang nguyên thủy.
 
Một thử nghiệm lâm sàng liên quan đến việc sử dụng chất ức chế PTEN kết hợp với chất kích thích PI3K để kích hoạt con đường PI3K–Akt, đã được thực hiện ở những BN POI. Hoạt hóa in vitro (in vitro activation - IVA) bằng phương thức hóa học là việc kích thích các mảnh vỏ buồng trứng người bằng bpV (HOpic) - chất ức chế PTEN và 740 Y-P là chất kích thích PI3K trong nuôi cấy mô trước khi ghép tự thân. Phương thức IVA hóa học (chemical in vitro activation – cIVA) này đã cho kết quả trẻ sinh sống thành công sau chu kì kích thích buồng trứng, chọc hút noãn và chuyển phôi. Tuy nhiên vẫn còn lo ngại vì con đường PI3K–Akt đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh lý khác nhau, bao gồm sự sống tế bào, sự tăng sinh và quá trình trao đổi chất, do đó nếu sử dụng con đường này có thể liên quan đến ung thư. Ngoài khả năng làm tăng nguy cơ hình thành khối u, ức chế PTEN có thể dẫn đến tích tụ tổn thương DNA.
 
Với những lo ngại đã đề cập, một phương thức mới được phát triển, tập trung vào tín hiệu Hippo, được gọi là “IVA cơ học”. IVA cơ học dựa trên quan sát “khi vỏ buồng trứng phân thành nhiều mảnh nhỏ (fragmentation) sẽ làm gián đoạn tín hiệu Hippo”, dẫn đến giảm sự thoái hóa và tăng tích tụ protein YAP -  nhân tố phiên mã hạ nguồn. Mức YAP tăng thúc đẩy hoạt hóa nang noãn. Tuy nhiên, tính hiệu quả và an toàn của các phương thức IVA hóa học và cơ học, cũng như cơ chế phân tử và tác động tổng thể lên mô buồng trứng vẫn còn gây tranh cãi và chưa được khám phá.
 
Trong nghiên cứu này, mục tiêu của nhóm tác giả là tìm hiểu tác động và cơ chế của IVA cơ học (sự phân mảnh đơn thuần, 'nhóm Frag') và cIVA (phân mảnh kết hợp bổ sung chất hóa học, 'nhóm Frag+cIVA') lên mô buồng trứng người bằng cách sử dụng phương pháp phân tích phiên mã, phương pháp đánh giá mô học và phương pháp phân tích steroid, cytokine và chemokin.
 
THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU
59 mẫu sinh thiết vỏ buồng trứng được lấy từ những BN POI đã đồng thuận nghiên cứu. Các mẫu được phân mảnh để nghiên cứu nuôi cấy.
 
Một nửa các mảnh được tiếp xúc với bpV (HOpic) + 740Y-P (nhóm Frag + cIVA) trong 24 giờ đầu tiên của quá trình nuôi cấy, một nửa còn lại được nuôi cấy với môi trường (nhóm Frag). Sau đó, cả hai nhóm được nuôi cấy chỉ với môi trường thêm 6 ngày. Các mẫu mô và môi trường sau nuôi cấy được thu thập để phân tích đánh giá mô học, phân tích phiên mã, phân tích hormone steroid và cytokine/chemokine tại các thời điểm khác nhau.
 
PHƯƠNG PHÁP
Đánh giá sự tác động lên nang noãn bằng cách đếm và chấm điểm các lát cắt đã nhuộm Hematoxylin và eosin trước và sau 7 ngày nuôi cấy. Chức năng nang noãn được đánh giá bằng định lượng steroid với phương pháp kết hợp sắc ký lỏng với khối phổ kế song song (LC/MS) tại các thời điểm khác nhau. Cytokine và chemokine được đo bằng xét nghiệm Multiplex.
 
Tác động phiên mã được đo bằng giải trình tự RNA (RNA-seq) của mô sau 24 giờ nuôi cấy ban đầu. Phân tích khác biệt biểu hiện gen (Selected differentially expressed genes - DEG) bằng PCR định lượng và miễn dịch huỳnh quang trong mô buồng trứng và các thí nghiệm nuôi cấy tế bào KGN (dòng tế bào khối u giống tế bào hạt ở buồng trứng người).
 
KẾT QUẢ
Sự hoạt hóa và phát triển của nang noãn được xác nhận bằng cách đếm số nang ở 2 nhóm Frag và Frag+cIVA. So với nhóm Frag, nhóm Frag+cIVA có tỷ lệ nang noãn sống cao hơn đáng kể, số lượng nang noãn thứ cấp tăng lên và kích thước nang noãn lớn hơn. Ngoài ra, mô trong nhóm Frag + cIVA sản xuất ít dehydroepiandrosterone (DHEA) hơn so với Frag. Kết quả cho thấy nuôi cấy in vitro kích hoạt các gen liên quan đến quá trình đường phân trong mô buồng trứng.
 
Phân tích cytokine cho thấy phản ứng viêm mạnh khi bắt đầu nuôi cấy ở cả hai nhóm. Dữ liệu RNA-seq cho thấy sự khác biệt không đáng kể giữa nhóm Frag+cIVA và Frag, với chỉ 164 DEG được xác định (FDR < 0,001). Ngoài con đường PI3K–protein kinase B (Akt), cIVA còn điều chỉnh các con đường liên quan đến tình trạng thiếu oxy, cytokine và tình trạng viêm.
 
So với mô buồng trứng mới thu thập, biểu hiện gen bị ảnh hưởng đáng kể ở cả 2 nhóm Frag+cIVA và nhóm Frag, với tổng số lần lượt là 3119 và 2900 DEG được xác định (FDR <0,001). Những thay đổi đáng kể so với mô tươi cũng được quan sát thấy trong biểu hiện của các gen mã hóa cho các enzyme sinh steroid và các dấu hiệu tế bào hạt ở cả hai nhóm. Các thí nghiệm nuôi cấy tế bào đã xác nhận các gen liên quan đến quá trình đường phân là mục tiêu trực tiếp của thuốc cIVA. Tóm lại, cIVA thúc đẩy sự phát triển nang noãn, nhưng cơ chế có thể phức tạp hơn so với PI3K–Akt–mTOR đơn lẻ và tác động đến chức năng và chất lượng của nang sau thời gian nuôi cấy vẫn là một câu hỏi chưa có lời giải.
 
THẢO LUẬN
Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã sử dụng phương pháp phân tích phiên mã, phương pháp đánh giá mô học và phương pháp phân tích steroid, cytokine và chemokin để đánh giá tác động của IVA cơ học (Frag) và hóa học (Frag+cIVA) lên mô buồng trứng người. Mặc dù đã có nhiều nỗ lực, nuôi cấy mô buồng trứng chỉ cho thấy thành công hạn chế trong việc thúc đẩy sự sống và trưởng thành của nang noãn, không có cải thiện đột phá nào được quan sát thấy trong nhiều điều kiện thử nghiệm khác nhau.
 
Đây là nghiên cứu đầu tiên phân tích những thay đổi về phiên mã bằng RNA-seq trong nuôi cấy mô buồng trứng. Dữ liệu RNA-seq của nhóm tác giả đã tiết lộ những thay đổi lớn trong quá trình chuyển hóa năng lượng. Nhóm nghiên cứu phát hiện ra rằng nhiều gen liên quan đến quá trình đường phân trung tâm và các chất điều hòa tăng mạnh trong ngày đầu tiên nuôi cấy ở cả hai nhóm. Đường phân là con đường chuyển hóa năng lượng được ưa chuộng trong các tế bào hạt, và sự tương tác lẫn nhau giữa các tế bào hạt và noãn trong quá trình chuyển hóa tế bào đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành nang noãn.
 
KẾT LUẬN
Nghiên cứu cung cấp bằng chứng cho thấy sự phân mảnh mô (IVA cơ học) và sự kết hợp giữa sự phân mảnh mô với hoạt hóa hóa học in vitro (cIVA) đều làm tăng hoạt hóa nang noãn người. Nhóm Frag+cIVA cho thấy tác dụng rõ rệt hơn đối với sự phát triển của nang.
Những thay đổi đáng kể về viêm và chuyển hóa năng lượng, nhấn mạnh sự cần thiết phải nghiên cứu chất lượng của nang có nguồn gốc từ mô bị phân mảnh hoặc mô nuôi cấy trước khi sử dụng trong các thử nghiệm lâm sàng. Ứng dụng lâm sàng của các phương thức IVA nhằm mục đích có thai lâm sàng nên cần được tiến hành thận trọng cho đến khi có thêm bằng chứng về tính an toàn. Cần theo dõi nguy cơ phát triển khối u ở những bệnh nhân đã được ghép mô buồng trứng.
 
Tài liệu tham khảo: Hao et al (2024). Effects of chemical in vitro activation versus fragmentation on human ovarian tissue and follicle growth in culture. Human reproduction open, 2024(3), hoae028. https://doi.org/10.1093/hropen/hoae028

Từ khóa: bảo tồn khả năng sinh sản, suy buồng trứng nguyên phát, phát triển nang noãn, biểu hiện gen, buồng trứng.