CNSH. Lê Thị Quỳnh – IVFMD SIH – Bệnh viện Phụ sản Quốc tế Sài Gòn
 
TỔNG QUAN
Sinh tinh là một quá trình phối hợp chặt chẽ bao gồm sự tăng sinh và biệt hóa tinh nguyên bào, phân chia giảm phân của tinh bào và biệt hóa sau giảm phân từ tinh tử tròn thành tinh trùng. Sự suy yếu của bất kỳ bước nào trong quá trình sinh tinh đều có thể gây ra chứng vô tinh không do tắc nghẽn (non-obstructive azoospermia - NOA), chiếm 20% tình trạng vô sinh ở nam giới.
 
Tiêm tinh tử tròn (round spermatid injection –    ROSI), một công nghệ hỗ trợ sinh sản, được thực hiện bằng việc tiêm tinh tử tròn (lấy từ sinh thiết tinh hoàn) vào noãn. Ở những bệnh nhân (BN) NOA có tinh tử tròn là tế bào mầm trưởng thành nhất trong tinh hoàn, ROSI được coi là phương sách cuối cùng để có con.
 
ADAD2 là một protein liên kết RNA mạch đôi được biểu hiện duy nhất trong tinh hoàn. Chuột đực thiếu ADAD2 (gọi là Adad2^ko) sẽ vô sinh do không có tinh trùng ở mào tinh hoàn do quá trình sinh tinh bị khiếm khuyết. Tuy nhiên, kiểu hình sinh sản của các đột biến ADAD2 được xác định ở người khác với kiểu hình ở chuột Adad2^ko và các tác động bệnh lý của các đột biến ADAD2 này chưa được xác minh trên mô hình chuột. Do đó, vai trò chức năng của ADAD2 trong quá trình sinh tinh ở người và các khiếm khuyết sinh tinh ở tinh hoàn do đột biến ADAD2 ở nam giới vô sinh cần được khám phá thêm.
 
Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã xác định được ba đột biến ADAD2 (MT1, MT2 và MT3) ở sáu BN NOA từ Pakistan. Những BN mang đột biến MT1 hoặc MT2 lưỡng bội có mức protein ADAD2 ở tinh hoàn giảm đáng kể và khiếm khuyết trong quá trình sinh tinh, phù hợp với quan sát ở chuột Adad2^ko. Chuột Adad2^Mut/Mut đực mang đột biến MT3 có kiểu hình vô sinh tương tự BN NOA. Điều đáng chú ý là mặc dù tinh tử tròn của chuột Adad2^Mut/Mut biểu hiện tổ chức chromatin bất thường, ROSI đã giúp chúng sinh ra con cái có khả năng sinh sản bình thường. Do đó, nghiên cứu này cung cấp bằng chứng trực tiếp in vivo và ex vivo rằng đột biến lưỡng bội ở ADAD2 gây ra NOA ở người và ROSI là phương pháp điều trị khả thi cho chuột Adad2^Mut/Mut có hiệu quả đột biến tương tự như BN NOA đột biến ADAD2.
 
THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU
Sáu BN nam vô sinh từ ba gia đình không có họ hàng đã được chẩn đoán mắc NOA tại các bệnh viện địa phương ở Pakistan dựa trên tiền sử vô sinh, nồng độ hormone giới tính, hai lần phân tích tinh dịch và siêu âm bìu. Sinh thiết tinh hoàn được thực hiện ở 2/6 BN.
 
Chuột đột biến Adad2 (Adad2^Mut/Mut) mang đột biến tương tự như đột biến được tìm thấy ở BN NOA được tạo ra bằng công cụ chỉnh sửa bộ gen CRISPR/Cas9. Kiểu hình sinh sản của chuột Adad2^Mut/Mut được xác minh lúc 2 tháng tuổi. Các tinh tử tròn từ chuột cùng lứa của chuột hoang dã (WT) và Adad2^Mut/Mut được chọn ngẫu nhiên và tiêm vào tế bào noãn WT.
 
Quy trình tiêm tinh tử tròn (ROSI) được thực hiện với ba nhóm Adad2^Mut/Mut, Adad2^WT/Mut, WT và > 400 hợp tử có nguồn gốc từ ROSI đã được đánh giá. Khả năng sinh sản của thế hệ con cháu có nguồn gốc từ ROSI được đánh giá trong ba tháng ở bốn con chuột đực Adad2^WT/Mut và sáu con chuột cái Adad2^WT/Mut. Tổng cộng có 120 chuột Adad2^Mut/Mut, Adad2^WT/Mut và WT đã được sử dụng trong nghiên cứu này. Toàn bộ nghiên cứu được thực hiện trong 3 năm.
 
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa “exome” (Whole-exome sequencing) đã được thực hiện để phát hiện các đột biến có khả năng gây bệnh ở 6 BN bị ảnh hưởng bởi NOA. Tính gây bệnh của các đột biến ADAD2 đã được xác định, đánh giá và xác nhận trong các mô tinh hoàn của người và trong các mô hình chuột.
 
Các đột biến ở những BN NOA được đánh giá bằng cách sử dụng PCR định lượng, phương pháp Western blotting, nhuộm Hematoxylin-eosin, nhuộm Periodic acid-Schiff và miễn dịch huỳnh quang. Tinh tử tròn của chuột WT và Adad2^Mut/Mut được thu thập bằng cách phân loại tế bào đánh dấu huỳnh quang và tiêm vào các tế bào noãn WT. Sự phát triển của con cái có nguồn gốc từ ROSI đã được đánh giá ở giai đoạn phôi thai và sau sinh.
 
KẾT QUẢ
Ba đột biến lặn MT1, MT2, MT3 đã được xác định trong ADAD2 ở những BN từ ba gia đình Pakistan không có quan hệ họ hàng. MT1 và MT2 làm giảm đáng kể biểu hiện ADAD2 ở tinh hoàn, có khả năng gây ra tình trạng suy giảm sinh tinh ở những BN NOA.
Phân tích miễn dịch huỳnh quang của chuột đực Adad2^Mut/Mut có đột biến MT3 tương ứng cho thấy sự bất ổn định và thoái hóa sớm của protein ADAD2, dẫn đến kiểu hình thiếu hụt sinh tinh. Thông qua ROSI, chuột Adad2^Mut/Mut có thể sinh ra những con chuột con có sự phát triển phôi (46,7% ở Adad2^Mut/Mut so với 50% ở WT) và tỷ lệ sinh (21,45 ± 10,43% ở Adad2^Mut/Mut so với 27,5 ± 3,536% ở WT, P = 0,5044) tương đương so ​​với chuột WT. Thế hệ con Adad2^Wt/Mut từ ROSI (tổng cộng 17 con trong 3 nhóm ROSI) không biểu hiện khiếm khuyết phát triển rõ ràng và có khả năng sinh sản bình thường khi trưởng thành.
 
Kết quả của nghiên cứu cho thấy ROSI có thể là phương pháp điều trị tiềm năng cho tình trạng vô sinh ở nam giới do đột biến ADAD2.
 
THẢO LUẬN
Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã xác định được ba đột biến ADAD2 lặn ở sáu BN NOA. Các đột biến ADAD2 được dự đoán là có khả năng gây bệnh từ dữ liệu WES kết hợp với các tiêu chí sàng lọc đột biến nghiêm ngặt. MT1/MT2 làm giảm nồng độ protein ADAD2 trong tinh hoàn và tạo ra những khiếm khuyết trong quá trình sinh tinh.
 
Protein ADAD2 chủ yếu được biểu hiện trong tế bào sinh tinh ở người và chuột. Nồng độ protein ADAD2 được quan sát thấy thấp hơn đáng kể ở những BN mang đột biến MT1 hoặc MT2, dẫn đến khiếm khuyết trong quá trình sinh tinh. Đột biến MT3 (chuột Adad2^Mut/Mut) có khả năng dẫn đến protein ADAD2 ngắn hơn 60% so với protein toàn phần và nhanh chóng bị phân hủy.
 
ROSI có thể được coi là một liệu pháp thay thế cho những BN mang đột biến ADAD2. Vào năm 2018, một cuộc khảo sát theo dõi 90 trẻ sinh ra từ ROSI cho thấy không có sự khác biệt đáng kể nào về sự phát triển thể chất và nhận thức trong hai năm đầu đời so với trẻ được thụ thai tự nhiên. Một nghiên cứu gần đây về bào thai và nhau thai của phôi chuột 11,5 ngày cũng cho thấy cấu hình phiên mã tổng thể và mức độ methyl hóa là tương tự nhau giữa chuột con ROSI và ICSI. Những phát hiện này giúp nâng cao hiểu biết về ROSI và cung cấp những manh mối có giá trị cho ứng dụng lâm sàng của ROSI.
 
Tổng kết lại, nhóm tác giả đã xác định được chức năng của ADAD2 trong quá trình sinh tinh ở người và xác minh mối quan hệ giữa các đột biến ADAD2 ở NOA trên người. Điều đáng chú ý là ROSI đã giúp tạo ra thế hệ con khỏe mạnh từ những con chuột Adad2^Mut/Mut vô sinh có tổ chức heterochromatin bất thường ở tinh tử tròn. Nghiên cứu đã cung cấp manh mối sơ bộ cho tư vấn di truyền về tình trạng vô sinh ở nam giới liên quan đến đột biến ADAD2.
 
Tài liệu tham khảo: Shi et al (2023). Biallelic mutations in RNA-binding protein ADAD2 cause spermiogenic failure and non-obstructive azoospermia in humans. Human reproduction open, 2023(3), hoad022. https://doi.org/10.1093/hropen/hoad022.
 

Từ khóa: vô sinh không tắc nghẽn, ADAD2, sinh tinh, tiêm tinh tử tròn, tư vấn di truyền.