CNSH. Nguyễn Trần Phương Duyên – IVFMD Tân Bình

1. Giới thiệu
CPLL (carboxylated poly-L-lysine) là một hợp chất polymer điện phân lưỡng cực trong đó nhóm carboxyl được tạo ra bằng cách phản ứng một phần nhóm amino của ε-poly-L-lysine. Do độc tính tế bào cực thấp, đặc tính bảo vệ đông lạnh cao và có ý kiến ​​​​cho rằng CPLL có thể làm giảm sự phân mảnh DNA tinh trùng (Sperm DNA fragmentation - SDF), vấn đề gần đây đã trở thành tâm điểm chú ý.
 
Trong nghiên cứu này, chúng tôi làm sáng tỏ một số tác dụng chưa được khám phá trước đây của CPLL đối với tinh trùng. Hơn nữa, đây là báo cáo đầu tiên xác định rằng resveratrol (RES) phối hợp với CPLL tăng cường tác dụng giảm SDF xảy ra trong quá trình đông lạnh tinh trùng người.
 
2. Vật liệu và phương pháp
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Các mẫu tinh trùng được sử dụng trong nghiên cứu này được thu thập từ 24 đàn ông khỏe mạnh (tuổi trung bình, 38,0 ± 6,5). Chỉ các mẫu tinh dịch có thông số bình thường theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO 2021) mới được nhận vào nghiên cứu. 

2.2. Môi trường trữ lạnh
Để kiểm tra tác dụng giảm SDF của CPLL, nghiên cứu đã sử dụng môi trường trữ có chứa CPLL (nhóm nghiên cứu) và không có CPLL (nhóm đối chứng), ở nhóm đối chứng cũng thay thế CPLL bằng HSA.
Hơn nữa, để chọn hợp chất chống oxy hóa nhằm tối ưu tác dụng giảm SDF, các môi trường trữ chứa các hợp chất chống oxy hóa khác nhau như canthaxanthin (CTX), astaxanthin (AXT), pyrroloquinoline quinone (PQQ) và resveratrol (RES) đã được thêm vào nghiên cứu nhằm so sánh hiệu quả các hợp chất chống oxy hóa này so với CPLL.
 
3. Kết quả
3.1. Tác động của CPLL đối với SDF
Môi trường trữ chứa CPLL, không chứa CPLL (CPLL-FREE) và môi trường thay thế CPLL bằng HSA. Môi trường trữ chứa CPLL làm giảm đáng kể SDF so với các môi trường trữ khác (CPLL-FREE 26,1 ± 3,7% so với CPLL 14,3 ± 1,9% so với HSA 24,6 ± 4,0%).

3.2. Tác động của CPLL đến mức ROS, LPO (Lipid peroxidation), MMP (Mitochondrial membrane potential) và tỷ lệ di động
ROS được sản sinh trong ty thể và một số ROS chuyển vào tế bào chất. Do đó, các phép đo được thực hiện tại hai vị trí: ty thể và tế bào chất. CPLL không cho thấy sự khác biệt đáng kể về ROS của ty thể (CPLL-FREE 72,5 ± 6,2% so với CPLL 69,1 ± 6,4% so với HSA 71,9 ± 6,1%), nhưng nó làm giảm đáng kể ROS trong tế bào chất (CPLL-FREE 33,4 ± 3,6% so với CPLL 27,1 ± 3,5% so với HSA 38,9 ± 5,5%). Hơn nữa, CPLL làm giảm đáng kể số lượng tế bào dương tính với 4-HNE, là dấu hiệu của LPO, tổn thương oxy hóa đối với màng tinh trùng (CPLL-FREE 59,9 ± 2,8% so với CPLL 34,5 ± 7,6% so với HSA 42,5 ± 6,0%).
MMP sẽ giảm khi tinh trùng bị tổn thương; do đó, MMP được đo như một dấu hiệu của tổn thương ty thể. CPLL cho thấy MMP cao hơn đáng kể so với hai nhóm còn lại (CPLL-FREE 55,2 ± 5,1% so với CPLL 65,5 ± 4,2% so với HSA 58,2 ± 4,7%). Vì khả năng di động của tinh trùng người có liên quan chặt chẽ với ROS và MMP nên khả năng di động cũng được đánh giá; CPLL cho thấy khả năng di động cao hơn đáng kể so với hai nhóm còn lại (CPLL-FREE 12,5 ± 2,6% so với CPLL 24,1 ± 4,7% so với HSA 16,1 ± 3,8%).

3.3. Tác động của các hợp chất chống oxy hóa khác nhau đối với SDF
Nghiên cứu đã đánh giá tác động của các nồng độ khác nhau của các hợp chất chống oxy hóa sau: CTX (1 µM, 10 µM, 100 µM), AXT (5 µM, 50 µM, 500 µM), PQQ (10 nM, 100 nM, 1000 nM), và RES (0,01 mM, 0,1 mM, 1 mM). Môi trường trữ tinh trùng chứa CTX (CPLL 44,8 ± 5,2% so với 1 µM CTX 36,1 ± 3,6% so với 10 µM CTX 40,0 ± 4,1% so với 100 µM CTX 43,6 ± 4,2%), AXT (CPLL 47,7 ± 6,5% so với 5 µM AXT 40,8 ± 3,3% so với 50 µM ATX 46,6 ± 6,1% so với 500 µM ATX 47,7 ± 6,5%) và PQQ (CPLL 29,6 ± 4,3% so với 0,01 pM PQQ 37,3 ± 4,1% so với 0,1 pM ATX 31,7 ± 3,9% so với 1 pM ATX 28,8 ± 3,5%), không khác biệt đáng kể ở bất kỳ nồng độ nào. Môi trường trữ chứa RES cho thấy tỷ lệ SDF giảm đáng kể khi bổ sung 0,1 mM RES, so với CPLL (CPLL 21,8 ± 2,9% so với 0,01 mM RES 21,2 ± 3,4% so với 0,1 mM RES 9,8 ± 1,4% so với 1 mM RES 32,3 ± 3,8%).

3.4. Tác động của RES đến mức ROS, LPO, MMP và tỷ lệ di động
Việc bổ sung RES làm giảm ROS trong ty thể (CPLL 70,7 ± 3,7% so với CPLL+RES 57,6 ± 5,5%) và tế bào chất (CPLL 28,0 ± 4,1% so với CPLL+RES 18,0 ± 2,3%). Hơn nữa, việc bổ sung RES làm giảm đáng kể số lượng tế bào dương tính với 4-HNE (một dấu hiệu của LPO) (CPLL 26,9 ± 4,7% so với CPLL+RES 22,6 ± 3,6%). Bên cạnh đó, nghiên cứu đã đánh giá nguyên nhân làm tăng sản sinh ROS, là một dấu hiệu cho thấy tổn thương ty thể. Việc bổ sung RES dẫn đến sự gia tăng đáng kể MMP, đây cũng là dấu hiệu cho thấy giảm tổn thương ty thể (CPLL 62,8 ± 4,2% so với CPLL+RES 66,7 ± 4,1%). Độ di động cũng được đo để đánh giá tác động của RES; tuy nhiên, không có sự khác biệt đáng kể nào được quan sát (CPLL 42,3 ± 4,9% so với CPLL+RES 43,4 ± 5,7%).
 
4. Bàn luận
Sự xuất hiện của SDF trong quá trình đông lạnh tinh trùng người chủ yếu là do sự thay đổi áp suất thẩm thấu nhanh chóng làm gia tăng ROS từ ty thể, dẫn đến SDF. ROS được tạo ra trong quá trình hô hấp hiếu khí của ty thể khi sản xuất ATP. Việc sản xuất ROS quá mức, vượt quá khả năng chống oxy hóa hạn chế của tinh trùng, làm hỏng ty thể, cản trở quá trình sản xuất ATP bình thường, gây ra sự rò rỉ các electron không được sử dụng dẫn đến tăng ROS và tạo ra LPO trong màng tinh trùng, nơi rất giàu axit béo không bão hòa. LPO tăng cao làm giảm tính linh động của màng tinh trùng và gây ra SDF. Do CPLL có ái lực cao với nước, nên khi hòa tan sẽ được tích hợp vào phần nước còn lại trong băng, ngăn chặn sự thay đổi áp suất thẩm thấu nhanh chóng trong quá trình đông lạnh. Ngoài ra, CPLL có ái lực thấp với màng tế bào ở 37°C và không liên kết với chúng; tuy nhiên, ở nhiệt độ thấp hơn, ái lực tăng lên và nó liên kết với màng tế bào. Phản ứng này xảy ra nhanh chóng do thay đổi nhiệt độ, hoạt động như một cơ chế bảo vệ sự nguyên vẹn của màng tinh trùng và chống lại tổn thương khi đông lạnh-rã đông, làm giảm thiểu những thay đổi áp suẩt thẩm thấu nhanh chóng, do đó có tác dụng ức chế tổn thương LPO và ty thể. Khả năng di động của tinh trùng phụ thuộc vào ATP do ty thể tạo ra và tổn thương ty thể làm suy yếu quá trình sản xuất ATP, dẫn đến tốc độ di chuyển giảm. Do đó, việc ức chế tổn thương LPO và ty thể là rất quan trọng để duy trì độ di động của tinh trùng cao.
 
Nhiều nghiên cứu đã làm sáng tỏ cơ chế hoạt động của RES như một chất chống oxy hóa. Khả năng bắt gốc tự do của RES là do nhóm hydroxyl phenolic của nó. Ngoài ra, tác dụng chống oxy hóa của RES thông qua việc kích hoạt sirtuin 1 (SIRT1) và yếu tố liên quan đến NF-E2 2. Việc bổ sung RES đã cải thiện LPO và MMP, nhưng không thấy có sự thay đổi nào về độ di động của tinh trùng. Điều này được cho là do tác dụng ức chế cyclooxygenase (COX) 1 của RES. RES cải thiện chức năng của ty thể bằng cách kích hoạt SIRT1, do đó làm tăng độ di động của tinh trùng. Ngược lại, RES còn có tác dụng ngược lại là ức chế chọn lọc COX1, một loại enzyme cần thiết cho quá trình tổng hợp prostaglandin 2, rất cần thiết cho sự di động của tinh trùng. Việc không giảm độ di động có thể là do tương tác đối kháng giữa kích hoạt SIRT1 và ức chế COX1, vì nồng độ RES được thêm vào thấp hơn so với báo cáo trước đây.
 
Nghiên cứu này còn một số hạn chế. Kiến ​​thức về tác dụng của CPLL và RES đối với môi trường trữ tinh trùng người chưa hiểu rõ. Bên cạnh đó, việc bảo quản lạnh tinh trùng được đánh giá trong vòng 1 tuần. Để bảo tồn khả năng sinh sản, tinh trùng có thể được lưu trữ trong nitơ lỏng trong vài năm hoặc lâu hơn. Vì vậy, trước khi áp dụng lâm sàng, cần đánh giá tác động lên tinh trùng do bảo quản trong thời gian dài.
 
5. Kết Luận
Nghiên cứu đã cho thấy CPLL có thể có khả năng chống oxy hóa gián tiếp, giảm SDF bằng cách ngăn chặn việc tạo ra ROS và LPO của màng tinh trùng trong quá trình đông lạnh - rã đông tinh trùng. Nghiên cứu cũng xác nhận rằng hợp chất chống oxy hóa tối ưu cho môi trường trữ tinh trùng có CPLL là 0,1 mM RES. RES bổ sung chức năng của các enzyme chống oxy hóa được cho là thiếu ở tinh trùng và ngăn chặn việc sản sinh ROS quá mức và gây nên hiện tượng LPO do đông lạnh, điều này có thể trực tiếp hoặc gián tiếp tránh được sự tăng cường SDF.
 
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tachibana R, Takeuchi H, Yoshikawa-Terada K, Maezawa T, Nishioka M, Takayama E, Tanaka H, Tanaka K, Hyon S-h, Gen Y, et al. Carboxylated Poly-L-lysine Potentially Reduces Human Sperm DNA Fragmentation after Freeze-Thawing, and Its Function Is Enhanced by Low-Dose Resveratrol. Cells. 2023; 12(22):2585. https://doi.org/10.3390/cells12222585

Từ khóa: Carboxylated poly-L-lysine; trữ lạnh ; ROS ; tinh trùng ; sự phân mảnh DNA của tinh trùng (SDF) ; chất chống oxy hóa