CVPH. Nguyễn Thuỵ Trà My, IVFMD – Bệnh viện Mỹ Đức
 
Trên thế giới, khoảng 30% trường hợp vô sinh có nguyên nhân đến từ nam giới. Trong đó, bất thường phổ biến nhất thường liên quan đến số lượng tinh trùng ít, độ di động kém hay bất thường về hình thái tinh trùng. Để cải thiện kết quả điều trị hỗ trợ sinh sản, nhiều kỹ thuật chọn lọc tinh trùng trong in vitro đã ra đời. Cho đến nay, hai phương pháp chọn lọc tinh trùng chủ yếu bao gồm phương pháp bơi lên (swim-up) và phương pháp ly tâm thang nồng độ (density-gradient centrifugation - DGC). Nguyên lý của những phương pháp chọn lọc này là dựa vào quá trình ly tâm để thu nhận tinh trùng. Do đó, mẫu tinh trùng sau chọn lọc thu nhận được nhiều tinh trùng di động tiến tới và hình thái tốt hơn so với chất lượng mẫu ban đầu. Tuy nhiên, việc ly tâm để thu nhận tinh trùng có thể tạo ra stress oxi hoá và kết quả làm tăng tỷ lệ DNA phân mảnh. Điều này có ảnh hưởng lớn đến kết quả phôi học cũng như kết quả lâm sàng.
 
Bên cạnh đó, ngoài những phương pháp truyền thống kể trên, một số phương pháp chọn lọc hiện đại khác như sử dụng từ tính (magnetic-activated cell sorting – MACs) hoặc thiết bị vi dòng chảy (microfluidics chip) để thu nhận tinh trùng. So với các phương pháp truyền thống, phương pháp MACs có thể phân tách được tinh trùng trải qua apoptosis thông qua sự gắn kết giữa Annexin-V với hạt từ tính và sự hiện diện của kháng nguyên phosphatidylserine bên ngoài màng tế bào. Tuy nhiên, phương pháp MACs vẫn được kết hợp với ly tâm để loại bỏ bớt các tế bào không phải là tinh trùng như bạch cầu hay tế bào tròn. Điều này có thể làm tăng công việc cho các chuyên viên phôi học. Ngoài phương pháp MACs, các thiết bị vi dòng chảy áp dụng nguyên lý trạng thái của chất lỏng và cử động của tinh trùng ở kích thước rất nhỏ (1-100mm) để chọn lọc tinh trùng. Đây là phương pháp duy nhất không sử dụng ly tâm trong chọn lọc tinh trùng so với các phương pháp khác.
 
Gần đây, một số thiết bị microfluidics chip đã được phát triển và ứng dụng như Qualis (Nhật Bản), Zech-selector (Úc), Miglis (Nhật) và Zymot (Mỹ). Ưu điểm của những thiết bị này là chọn lọc được tinh trùng có chất lượng tốt hơn về độ di động cao, tỷ lệ phân mảnh DNA thấp, hình thái và chức năng ty thể bình thường. Tuy nhiên, nhược điểm là thiết bị chọn lọc ở thể tích mẫu ít (Qualis), hiệu quả chọn lọc không đồng nhất khi cầu mao dẫn hình chữ U không được làm đầy đúng cách (Zech-selector), thời gian xử lý mẫu dài (Miglis) hay chi phí đầu tư ban đầu cao và mẫu sau lọc có nguy cơ nhiễm các loại tế bào khác tinh trùng, mảnh vỡ tế bào (Zymot). Do đó, nhóm nghiên cứu ở Đài Loan kết hợp với Trung tâm Y học sinh sản Mỹ đã phát triển một kỹ thuật chọn lọc tinh trùng sử dụng thiết bị Lenshooke® CA0 (CA0). Thiết bị này có tích hợp màng lọc vi xốp và việc chọn lọc dựa vào khả năng bơi của tinh trùng trong môi trường vi mô. Qua bài phân tích này, nhóm nghiên cứu đưa ra các kết quả về (1) điều kiện tối ưu khi sử dụng thiết bị CA0 để chọn lọc tinh trùng; (2) đánh giá và so sánh chất lượng tinh trùng sau khi chọn khi sử dụng thiết bị CA0, phương pháp DGC và thiết bị Zymot.
 
 
Thiết kế nghiên cứu
Tiêu chuẩn nhận:

• Cặp vợ chồng vô sinh trong độ tuổi 20-65 tuổi
• Chất lượng tinh trùng bình thường theo WHO 2010

Tiêu chuẩn loại

• Mẫu Azoospermia
• Mẫu xuất tinh có thể tích (V) ít hơn 1,5ml, mật độ tinh trùng < 15 triệu tinh trùng (TT)/ml, tổng di động < 40% và hình dạng bình thường < 4%

Sau khi phân loại dựa vào tiêu chuẩn nhận/loại, tổng cộng 119 cặp vợ chồng được nhận vào nghiên cứu. Mỗi mẫu tinh dịch có tổng thể tích tối thiểu để được đưa vào nghiên cứu phân tích là 2,85ml. Nếu mẫu tinh dịch có thể tích ít hơn 2,85ml thì mẫu sẽ được pha thêm môi trường mHTF để đủ thể tích cho nghiên cứu.
 
Chuẩn bị mẫu:

• Phân tích chất lượng mẫu ban đầu: mẫu tinh dịch được đánh giá các chỉ số như mật độ, độ di động, hình dạng theo WHO 2010, tỷ lệ DNA phân mảnh bằng thiết bị Lenshooke R10, phản ứng acrosome tự phát (AR) bằng phương pháp nhuộm Pisum sativum agglutinin kết hợp chất phát huỳnh quang isothiocyanate (PSA-FITC, Mỹ).
• Chọn lọc tinh trùng: mẫu tinh dịch của mỗi bệnh nhân sẽ được chia làm 3 phần cho 3 phương pháp chọn lọc tinh trùng khác nhau:

1. Chọn lọc bằng thiết bị CA0: mẫu tinh dịch được chọn lọc ở 37^oC ở các thời gian ủ khác nhau (5, 10, 30 và 60 phút) và chọn lọc trong 30 phút ở các nhiệt độ khác nhau (20^oC, 25^oC, 37^oC), DGC và thiết bị Zymot.
2. Chọn lọc bằng DGC.
3. Chọn lọc bằng Zymot.

 
 
 
 
 
  
Hình 1: Thiết bị CA0 trong chọn lọc tinh trùng dựa vào độ di động. (a) Thiết bị CA0 gồm 3 phần: buồng dưới, buồng trên với màng lọc polycarbonate và cổng thu nhận mẫu sau lọc. (b) Các bước chọn lọc mẫu tinh trùng: (1) đặt buồng dưới trên bề mặt phẳng, (2) thêm 1ml mẫu tinh dịch vào buồng dưới cho đến khi mẫu tinh dịch đầy buồng, (3) đặt buồng trên lên phía trên buồng dưới, (4) thêm 0,9ml môi trường rửa tinh trùng vào buồng trên, (5) đậy nắp vào thiết bị CA0 và ủ trong 37^oC, (6) thu nhận 0,5ml huyền phù tinh trùng ở buồng trên. (c) Những tinh trùng có khả năng di động tiến tới sẽ bơi qua màng lọc và hướng lên buồng trên. Trong khi đó, những tinh trùng bất động, di động tại chỗ hay tế bào khác sẽ được giữ lại ở buồng dưới.
 
Kết quả:

1. Đánh giá điều kiện tối ưu khi sử dụng thiết bị CA0 để chọn lọc tinh trùng

Thời gian ủ:

• 59 mẫu được đưa vào phân tích: 19 mẫu có chất lượng bình thường (nhóm 1) và 40 mẫu có chất lượng dưới chuẩn bình thường (nhóm 2).
• Mật độ tinh trùng di động (motile sperm concentration – MSC) tăng ở cả 2 nhóm: MSC ở nhóm 1 là 0,6; 0,7; 2,4; 3,5 triệu TT/ml và nhóm 2 là 0,3; 0,4; 0,8 và 0,8 triệu TT/ml lần lượt trong các thời gian ủ là 5, 10, 30 và 60 phút.
• Thời gian ủ tối ưu để chọn lọc tinh trùng di động tiến tới là 30 phút (95,7% đối với nhóm 1 và 94,3% đối với nhóm 2).

 
Nhiệt độ ủ

• 61 mẫu tinh dịch được đưa vào phân tích: 23 mẫu ở nhóm 1 và 38 mẫu nhóm 2
• Tổng di động ở cả 2 nhóm lần lượt là 81,3%, 90,6%, 91,9% (nhóm 1) và 55,9%, 79,3%, 80,1% (nhóm 2) ở 20^oC, 25^oC, 37^oC.
• Mật độ tinh trùng di động (MSC): khi ủ ở 25^oC và 30^oC cho thấy cao hơn đáng kể  20^oC (lần lượt là 0,7 triệu TT/ml; 1,5 triệu TT/ml so với 0,6 triệu TT/ml) đối với nhóm 1. Trong khi đó, nhiệt độ ủ ở 37^oC (1,1 triệu TT/ml) ở nhóm 2 là cao hơn đáng kể so với 20^oC (0,3 triệu TT/ml) và 25^oC (0,4 triệu TT/ml).
• Nhiệt độ ủ tối ưu cho mật độ và độ di động của tinh trùng sau lọc là 37^oC.

 

2. So sánh chất lượng tinh trùng và hiệu quả khi lọc rửa bằng DGC, Zymot và CA0

Chọn lọc tinh trùng có chất lượng bình thường

• Số lượng tinh trùng di động tiến tới ở cả 3 phương pháp lọc được nhận thấy giảm so với chất lượng mẫu ban đầu.
• Chất lượng tinh trùng sau lọc có cải thiện hơn so với mẫu ban đầu khi lọc rửa bằng Zymot và CA0. Đặc biệt là phương pháp chọn lọc tinh trùng bằng CA0 tốt hơn đáng kể so với 2 phương pháp còn lại về tổng di động tiến tới là 90,8%, di động tiến tới nhanh là 83,6%, hình dạng bình thường là 10,3%, DFI là 2,4% và phần trăm AR (acrosome-reacted sperm) là 4,7%.

Chọn lọc tinh trùng có chất lượng dưới chuẩn bình thường

• Chất lượng mẫu sau lọc được cải thiện đáng kể (trừ nồng độ và số lượng tinh trùng di động) ở cả 3 phương pháp. Tuy nhiên, phần trăm AR ở mẫu chọn lọc bằng DGC không thay đổi so với ban đầu. Hơn nữa, chỉ số DFI khi chọn lọc tinh trùng bằng DGC tăng đáng kể so với mẫu ban đầu (18,2% và 13,9%,             p < 0,05).
• Chất lượng mẫu sau lọc cho thấy ưu việt hơn đáng kể khi nhóm chọn lọc bằng CA0 với độ di động, di động tiến tới nhanh, hình thái bình thường, DFI lần lượt là 80,4%, 74,2%, 8,5% và 4% so với nhóm DGC và Zymot (p < 0,05).

Hiệu quả về tỷ lệ thu hồi của các phương pháp so sánh

• Khi chọn lọc bằng Zymot và CA0 cho thấy hiệu quả cao hơn so với DGC. Hơn nưã, giữa 2 phương pháp Zymot và CA0 thì chọn lọc tinh trùng bằng CA0 (giảm 73%) cho phần trăm DFI giảm nhiều hơn Zymot (giảm 52,9%) so với chất lượng mẫu ban đầu.

 
Kết luận:

• Chọn lọc tinh trùng bằng CA0 cho thấy hiệu quả ở cả nhóm 1 và nhóm 2 về chất lượng tinh trùng sau lọc, đặc biệt là tỷ lệ DFI.
• Điều kiện tối ưu khi sử dụng CA0 trong chọn lọc tinh trùng là 30 phút ở 37^oC.
• Chọn lọc tinh trùng bằng CA0 là phương pháp hạn chế sự ly tâm và dễ dàng vận hành. Do đó, đây là hướng phát triển mới trong kỹ thuật chọn lọc tinh trùng cho điều trị hỗ trợ sinh sản.

 
 
Tài liệu tham khảo: Hsu CT, Lee CI, Lin FS, Wang FZ, Chang HC, Wang TE, Huang CC, Tsao HM, Lee MS, Agarwal A. Live motile sperm sorting device for enhanced sperm-fertilization competency: comparative analysis with density-gradient centrifugation and microfluidic sperm sorting. J Assist Reprod Genet. 2023 Aug;40(8):1855-1864.

Từ khóa: DGC, Zymot, Lenshooke CA0, microfluidics, vi dòng chảy, chọn lọc tinh trùng