CNSH. Khổng Tiết Mây Như – IVFMD

Khoảng 1 trong 100 nam giới khỏe mạnh bị vô tinh và các trường hợp vô tinh không do tắc chiếm 70-80%. Micro-TESE là phương pháp điều trị duy nhất để tìm thấy tinh trùng với xác suất phát hiện tinh trùng trong tinh hoàn là 30-60%, trong đó khoảng 1 nửa số tinh trùng là bất động hoặc dị dạng. Vì vậy, bệnh nhân sẽ mất cơ hội là người cha sinh học và phải sử dụng tinh trùng hiến tặng nếu không tìm thấy tinh trùng. Năm 1993, Ogura và Yanagimachi lần đầu báo cáo khả năng thụ tinh của tinh tử tròn ở chuột hamster bằng kỹ thuật tiêm tinh tử tròn vào bào tương noãn (round spermatid injection – ROSI). Tinh tử tròn phát triển sau 2 lần giảm phân, có cùng số lượng nhiễm sắc thể (NST) và phân tử DNA như tinh trùng trưởng thành. Sau khi tiêm vào noãn và với sự kích hoạt tế bào noãn thích hợp, tinh tử tròn có khả năng thụ tinh giống như tinh trùng trưởng thành. Ở người, em bé bình thường được sinh ra từ ROSI vào năm 1996, tiếp nối là loạt các báo cáo về 8 thai kì ở người và 7 trẻ sinh ra. Dữ liệu lâm sàng của 90 trẻ sinh ra sau ROSI có khả năng thể chất và nhận thức không khác biệt đáng kể so với thụ thai bình thường đã được báo cáo ở Fertility và Sterility năm 2018. Tuy nhiên, kết quả lâm sàng sau ROSI vẫn còn thấp. Nhiều nghiên cứu trước đó của tác giả đã làm sáng tỏ nguyên nhân chính của kết quả lâm sàng kém là vì bất thường thượng di truyền do sự khác biệt của protein hạt nhân trong tinh tử tròn (histone) và tinh trùng trưởng thành (protamine). Do đó, dựa trên báo cáo đã có về những tác dụng có lợi đối với việc điều chỉnh bất thường thượng di truyền, đây là bài tổng quan về lịch sử của ROSI và tham khảo cách sửa đổi bất thường thượng di truyền mà không vi phạm các hướng dẫn về chỉnh sửa gene.
 
CƠ SỞ LÝ LUẬN CHO ROSI
Quá trình thụ tinh được hoàn thành bằng sự hợp nhất của tế bào noãn với tinh trùng và được kích hoạt bởi sự hoạt hóa noãn. Sự tương tác giữa các thụ thể bổ sung trên màng sinh chất của tinh trùng và noãn kích hoạt sự hoạt hóa protein G, từ đó sản xuất inositol triphosphate giải phóng Ca²⁺ từ mạng lưới nội chất. Trong khi đó, ICSI giúp giải phóng yếu tố dao động Ca²⁺ từ tinh trùng được tiêm đã kích hoạt cơn sóng hoạt hóa tế bào noãn. Bằng cả 2 cách, sự giải phóng Ca²⁺ bắt đầu tỏa vào toàn bộ tế bào chất và tiếp tục quá trình phân chia tế bào giảm phân II, dẫn đến sự đùn ra của thể cực II và sự xuất hiện của 2 tiền nhân. Tinh tử tròn có bộ NST đơn bội 23 và hàm lượng DNA 1N giống như một tinh trùng trưởng thành. Vì vậy, nếu tinh tử tròn không đuôi có thể được tiêm trực tiếp vào noãn bằng kỹ thuật tương tự như ICSI thì vẫn thụ tinh được với noãn và sinh em bé.
 
Tinh tử tròn có thể tồn tại trong tinh hoàn người cùng với sự hiện diện của tinh trùng trưởng thành hay ngay cả khi không có tinh trùng được tìm thấy. Dữ kiện mới cho thấy nam giới có đột biến gene của bộ điều biến yếu tố đáp ứng cAMP (cyclic AMP-responsive element modulator – CREM) có sự ngừng trưởng thành ở tinh tử tròn (TAF4B và ZMYND15). Những sự thật này cho thấy cần có sự xem xét lại tính hữu ích của ROSI. Tuy nhiên, tinh tử tròn có thể được tìm thấy trong 30-40% trường hợp không tìm thấy tinh trùng sau Micro-TESE; điều này mang đến cơ hội làm cha sinh học nếu sử dụng tinh tử tròn của chính họ thay vì phải dùng tinh trùng hiến tặng.
 
Hiện nay, 22 bản thảo về ROSI với đầy đủ thông tin để thực hiện phân tích lâm sàng đã được xem xét. Các báo cáo gồm thông tin về số lượng noãn được tiêm, tỉ lệ thụ tinh, tỉ lệ mang thai lâm sàng, sẩy thai, loại hoạt hóa tế bào noãn, phương pháp thu nhận tinh tử tròn, hệ kính quang học được sử dụng và liệu tinh tử tròn là tươi hay đông lạnh. 
 
PHÂN TÍCH LÂM SÀNG SAU ROSI
Các bản thảo đầu tiên được công bố trên ROSI đã chỉ ra rằng các phương pháp có thể bị nghi ngờ về mặt nhận dạng hình thái hoặc kích hoạt tế bào noãn. Tuy nhiên, họ đã xác định được các rủi ro di truyền, thượng di truyền và NST mà ROSI có thể gây ra. Họ dự đoán dấu ấn di truyền, thay đổi liên kết DNA với protein hạt nhân, đồng bộ hóa chu kì tế bào và quá trình methyl hóa DNA. Cơ chế về các bất thường thượng di truyền có thể xảy ra hoặc giải pháp điều trị vẫn được đề cập đến.
 
Chọc hút noãn mạnh, canxi ionophore, ionomycin, kích thích điện là phương pháp hoạt hóa noãn. Trong đó, kích thích điện được xem là hiệu quả nhất đối với ROSI, ảnh hưởng của mỗi lần kích hoạt noãn được kiểm tra bằng dao động Ca²⁺.
 
Tinh tử tròn sau xuất tinh không đủ cho ROSI so với thu trong tinh hoàn do khả năng cao xảy ra sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của tinh tử tròn và khả năng cao tồn tại tinh trùng trong cùng một lần xuất tinh. Cho đến nay, 4 trường hợp thực hiện ROSI bằng tinh tử tròn khi xuất tinh và 20 trường hợp còn lại sử dụng tinh tử tròn trong tinh hoàn. Ngoài ra, những báo cáo ban đầu về ROSI thì chỉ có 4 ca sử dụng tinh tử tròn đông lạnh, 16 ca còn lại sử dụng tinh tử tươi. 2 ca sinh bé đã sử dụng phương pháp thủy tinh hóa. Hiện nay, đông lạnh chậm là phương pháp đông lạnh tinh tử tròn được chứng minh là hiệu quả hơn so với thủy tinh hóa dựa trên tỉ lệ phục hồi sau rã lần lượt là 70-80% so với 20-30%.
 
Ba loại tế bào sinh tinh (tinh trùng, elongated, elongating spermatids) được báo cáo trong các trường hợp của Tanaka đều bị ngừng phát triển ở giai đoạn tinh tử tròn nhưng trong 20 nhóm được công bố trước đó, chúng đã bị trộn lẫn. Định nghĩa chặt chẽ về ROSI đã mô tả tinh tử tròn thu được từ các trường hợp ngừng trưởng thành hoàn toàn ở giai đoạn tinh tử tròn. Kết quả ROSI sử dụng tinh tử tròn ngừng trưởng thành hoàn toàn thấp hơn đáng kể với tinh tử ngừng trưởng thành không hoàn toàn. Sự khác biệt này có thể do mức độ chuyển đổi của protein nhân, histone thành protamine; từ đó, tinh tử tròn phát triển thành elongating hoặc elongated cho các nhóm nhà nghiên cứu bắt đầu thực hiện nuôi cấy trong ống nghiệm.
 
Kết quả lâm sàng sau ROSI trong 20 bài báo cáo, so sánh giữa nhóm trước đó (1996-2015) và nhóm Tanaka (2015 & 2018):
-Tỉ lệ thụ tinh: 36,60±15,53% & 58,15±1,95%
-Tỉ lệ thai lâm sàng: 18,47±15,91% & (tinh tử tươi: 10,98±7,84%; tinh tử đông lạnh: 19,8±5,7%)
-Tỉ lệ sẩy thai: 4,76±12,59% & (tinh tử tươi: 54,38±15,02%; tinh tử đông lạnh: 40,52±13,41%)
-Tỉ lệ trẻ sinh sống: 6,12% & (tinh tử tươi: 3,27%; tinh tử đông lạnh: 10,76%)
-Số trẻ sinh: 9/147 & (tinh tử tươi: 52/1592; tinh tử đông lạnh: 44/409).
Sự khác biệt lớn về kết quả này có thể do sự quan sát dưới kính của tinh tử tròn bằng Hoffman hoặc Nomarski, phương pháp chuẩn bị tinh tử khác nhau với môi trường có hoặc không sử dụng DNase và collagenase để phân lập tế bào sinh tinh.
 
NUÔI CẤY IN-VITRO TẾ BÀO TINH TRÙNG NGƯỜI
Không có báo cáo chỉ ra rằng việc ngừng trưởng thành ở giai đoạn tế bào sinh tinh sơ cấp tiếp tục quá trình sinh tinh cùng giảm phân I & II hay sự sinh tinh gần như hoàn chỉnh. Năm 2002, Sousa và cộng sự báo cáo hệ thống đồng nuôi cấy mới sử dụng môi trường điều hòa Vero cell với FSH và Testosterone (T) trong 2-3 tuần. Tỉ lệ thụ tinh và tỉ lệ phôi nang của tinh tử tròn và elongating spermatid lần lượt là 37,5%; 28,6% và 30,5%; 42,9%. Tuy nhiên hầu hết các phôi không đạt được đến phôi dâu và có nhiều bất thường lớn về NST giới tính. Năm 2003, khi nuôi cấy trên lớp trung chuyển (feeder layer) của Vero cell trong môi trường MEM+50% dịch vòi trứng tổng hợp của người +10% huyết thanh người trong 1 tuần. Tỉ lệ tạo tinh tử tròn là 4,4% (5/120). Tuy nhiên, không có tinh tử nào phát triển nếu không đồng nuôi cấy với Vero cell. Năm 2009, Tanaka đã báo cáo sự biệt hóa đầu tiên của tinh tử tròn thành tinh trùng di động thông qua nuôi cấy in-vitro với Vero cell. Tỉ lệ trưởng thành đến elongating spermatid (36,0%), elongated spermatids (14,0%), tinh trùng với đuôi bất động/di động (0%). Hai tinh trùng với hình dạng đầu bình thường, đuôi cử động được khẳng định lần đầu trên thế giới nhưng chưa được phép ứng dụng lâm sàng vì kết cục lâm sàng quá thấp.
 
BIẾN ĐỔI BIỂU SINH CỦA DNA GIAO TỬ Ở NAM
Nhược điểm cuối của ROSI dường như là phiên bản chuyển tiếp không hoàn chỉnh của protein hạt nhân của histone trong tinh tử tròn thành protamine trong tinh trùng trưởng thành. Quá trình methyl hóa DNA và các dạng sửa đổi histone được thiết kế cho sự phát triển bình thường của phôi, bị thay đổi hoàn toàn trong chất nhiễm sắc của giao tử đực trước và sau khi thụ tinh. Nguy cơ bất thường thượng di truyền được xem xét dựa trên mức độ thiết lập của sửa đổi thượng di truyền trong tinh tử tròn và tỉ lệ làm tổ thấp của phôi ROSI. Quá trình methyl hóa DNA thường hoạt động để ức chế quá trình phiên mã bằng cách ngăn chặn sự liên kết của các yếu tố phiên mã, cần thiết để bắt đầu biểu hiện gene. Thêm vào đó, methyl hóa DNA là cần thiết để khử hoạt tính X và biểu hiện các gene in dấu của cha mẹ. Mặc dù các dạng methyl hóa DNA được duy trì trong các tế bào tăng sinh và biệt hóa bằng cách duy trì các chất chuyển methyl khi sao chép DNA và các chất chuyển methyl de novo nhưng quá trình khử methyl toàn bộ và tái tạo liên tiếp các dạng methyl hóa xảy ra trong quá trình tạo giao tử (nhân tinh trùng và tế bào noãn) và phân tách tế bào sau thụ tinh. Tuy nhiên, nhân DNA của cha được sửa đổi độc lập với quá trình sao chép DNA, 5mC trong các vị trí CpG của cha, ngoại trừ gene in dấu, nhanh chóng được chuyển đổi thành 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) nhờ hoạt động enzyme của protein TET trước khi sao chép DNA phôi đầu tiên. Sau đó, sự giảm dần 5hmC xảy ra tùy thuộc vào sự sao chép DNA trong DNA mẹ mặc dù quá trình khử methyl được bắt đầu bởi DNA methyltransferase 3 chủ yếu xảy ra trong DNA mẹ. Các các dạng methyl hóa DNA hợp tử đã được thiết lập lại trong khối tế bào bên trong ở giai đoạn phôi nang.
 
Biến đổi histone cũng điều chỉnh các biểu hiện gene trong quá trình phát triển phôi. Bốn loại lõi histone (H2A, H2B, H3 và H4) tạo thành nucleosome cùng với 147 cặp base của DNA sợi kép. Quá trình acetyl hóa histone gây ra bởi các men chuyển histone acetyl, có liên quan đến hoạt hóa phiên mã, làm thay đổi cấu trúc NST để lộ vùng DNA cần thiết cho quá trình phiên mã. Trong sinh tinh, các tinh tử tròn thay thế các protein hạt nhân bằng protamine thay vì các lõi histone để trở thành tinh trùng trưởng thành trong khi hoàn thành quá trình methyl hóa DNA, cùng với nhân cô đặc xâm nhập vào tế bào noãn, quá trình khử và tái cấu trúc chất nhiễm sắc (tái thay thế protamine thành histone) của nhân tinh trùng được thúc đẩy bởi nhân sinh chất (nucleoplasmins) chứa trong noãn bào trong vài giờ và sau đó một nhân đực được hình thành. Trong quá trình tái cấu trúc chất nhiễm sắc, quá trình trimethyl hóa histone H3K9 có liên quan quá trình bất hoạt gene (gene silencing) được duy trì ở mức rất thấp trong tiền nhân đực, so với tiền nhân cái, mặc dù mức acetyl hóa H3 và H4 cao vẫn được duy trì ở cả tiền nhân đực và cái. Trong phôi ROSI, việc thiếu methyl hóa và sắp xếp lại histone được thiết lập trong quá trình sinh tinh sẽ phải phục hồi để phôi phát triển bình thường và trẻ được sinh ra thành công.
 
SỰ BẤT THƯỜNG THƯỢNG DI TRUYỀN Ở PHÔI ROSI
Một nghiên cứu so sánh giữa phôi chuột ICSI và ROSI đã cho rằng các lỗi thượng di truyền có liên quan đến sự phát triển kém của phôi ROSI. Trong 90% phôi chuột ROSI, quá trình hypermethyl hóa được tìm thấy ở tiền nhân đực, so với tiền nhân đực ở phôi ICSI. Các dạng methyl hóa DNA của tinh tử được tiêm được sao chép trực tiếp bằng cách duy trì methyltransferase thông qua sao chép DNA vì nhân của tinh tử đã bỏ qua quá trình khử methyl bằng cách chuyển đổi 5mC thành 5hMC đồng thời với quá trình thay thế histone-protamine. Do đó, DNA của tiền nhân đực được khử bằng methyl hóa đã vô tình chuyển giao thành công ở phôi ROSI. Tuy nhiên, sàng lọc di truyền của trẻ em từ ART cho thấy các rối loạn dấu ấn tương tự phát sinh trong quá trình nuôi cấy in-vitro của phôi phân chia giai đoạn sớm, cụ thể là quá trình khử methyl của các gene in dấu (H19) có liên quan đến hoạt động của ART ở chuột và người. Dù vậy, Novakovic và cộng sự cũng từng chỉ ra rằng chứng rối loạn methyl hóa liên quan đến ART ở trẻ sơ sinh phần lớn sẽ tự khỏi khi trưởng thành, không có bằng chứng trực tiếp nào về ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự phát triển và sức khỏe của chúng. Đây là một kết quả đầy hy vọng giúp loại bỏ được mối lo ngại trên nên các nghiên cứu sâu hơn sẽ rất quan trọng để theo dõi kết quá của phôi bị bất thường trong quá trình methyl hóa.
 
PHỤC HỒI KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI ROSI
Để cải thiện tỉ lệ thành công của ROSI, việc ứng dụng đa dạng các chất nhằm ức chế quá trình methyl hóa DNA bất thường của tinh tử chuột từ tạo tiền nhân thành phôi được nghiên cứu. Trichostatin A và Scriptaid ức chế quá trình khử acetyl histone và liên tục tăng cường hoạt động phiên mã và biểu hiện protein. Phôi ROSI sau khi thụ tinh bằng Trichostatin A trong 20h đã giảm mức hypermethyl hóa của tiền nhân đực. Các tinh tử tròn tiếp xúc với Trichostatin A (100nM, 45mins) trước ROSI cho phản ứng tương tự giúp nâng cao chất lượng phôi nang (số lượng ICM và biểu hiện marker ICM). Hơn nữa, Scriptaid (250mM, 10h) đối với phôi chuột ROSI ở giai đoạn tiền nhân giúp cải thiện sự hình thành phôi nang và tỉ lệ sinh khôi phục biểu hiện gene và quá trình methyl hóa DNA bất thường. Chẳng những vậy, một hợp chất A366 (300nM, 20h) được chọn sau sàng lọc các hợp chất nhỏ liên quan đến biến đổi thượng di truyền có hiệu quả với sự phát triển bình thường của phôi chuột ROSI và cải thiện các bất thường thượng di truyền. Các nghiên cứu sử dụng Scriptaid và A366 từng báo cáo rằng bé sinh ra từ phôi chuột ROSI vẫn khỏe mạnh và có khả năng sinh sản. Vì vậy, việc sử dụng các hợp chất này có khả năng cải thiện tỉ lệ thành công của ROSI ở người mặc dù vẫn còn những lo ngại về đạo đức.
 
Nguồn: Tanaka A và Watanabe Seiji. How to improve the clinical outcome of round spermatid injection (ROSI) into the oocyte: Correction of epigenetic abnormalities. Reprod Med Biol. 2023 Jan 10.

Từ khóa: Cách cải thiện kết cục lâm sàng của kỹ thuật tiêm tinh tử tròn vào bào tương noãn (ROSI): hiệu chỉnh các bất thường thượng di truyền