CNSH. Nguyễn Trung Kiên – IVF Vạn Hạnh, Bệnh viện Vạn Hạnh.

1. Giới thiệu

Tinh trùng có khả năng di chuyển về phía trước trong quá trình vận chuyển qua mào tinh hoàn và khi ở trong đường sinh dục nữ, chúng trải qua nhiều thay đổi chức năng và hóa sinh học, được gọi chung là sự hoạt hóa chức năng tinh trùng (capacitation). Sự trưởng thành của tinh trùng chỉ hoàn thành khi tinh trùng trải qua quá trình hoạt hóa chức năng. Quá trình này là điều kiện tiên quyết để thụ tinh vì chỉ những tinh trùng đã hoạt hóa mới có thể trải qua phản ứng thể cực đầu (acrosome reaction), xâm nhập qua màng trong suốt (ZP), sau đó hòa màng với noãn và thụ tinh. Do đó, sự hoạt hóa chức năng và phản ứng thể cực đầu là hai quá trình rất quan trọng quyết định khả năng thụ tinh của tinh trùng. Bất kỳ sự bất thường nào ảnh hưởng đến các quá trình này đều có thể dẫn đến vô sinh.
 
Sự biểu hiện gene và tổng hợp protein của tinh trùng bị ngừng lại trong quá trình vận chuyển của tinh hoàn và sự trưởng thành của tinh trùng được điều hòa bởi các tương tác giữa tinh tương và protein trên bề mặt tinh trùng. Vì vậy, việc nghiên cứu về sự thay đổi biểu hiện của các protein (proteomic) tinh trùng trong quá trình hoạt hóa chức năng và phản ứng thể cực đầu trở nên quan trọng. Điều này giúp chúng ta hiểu đầy đủ các quá trình mà tinh trùng trải qua trong hành trình thụ tinh của chúng. Ví dụ, hoạt hóa chức năng tinh trùng là một quá trình rất phức tạp được điều chỉnh bởi nhiều yếu tố khác nhau. Đầu tiên, các protein khảm màng trên tinh trùng được loại bỏ, việc này cũng thúc đẩy cholesterol giải phóng, làm mất ổn định màng tinh trùng nhờ tăng tính thấm của màng. Sau đó, thông qua sự kích thích của các kênh xuyên màng, dòng Ca²⁺ tăng lên, dẫn đến pH nội bào cao hơn. Từ đó kích hoạt các con đường truyền tin thứ cấp. Con đường kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào (ERK) cũng kích hoạt giúp tăng cường quá trình phosphoryl hóa protein, nổi bật là quá trình phosphoryl tyrosine thông qua adenylyl cyclase hoạt động như một tín hiệu nội bào. Khi tất cả những sự kiện này được hoàn thành, tinh trùng sẽ phản ứng thể cực đầu. Phản ứng thể cực đầu là một quá trình ngoại bào phụ thuộc Ca²⁺ dẫn đến việc giải phóng tuần tự các enzym thủy phân và phân giải protein như acrosin và hyaluronidase. Các enzyme được phóng thích sẽ bào mỏng ZP và cho phép tinh trùng xâm nhập, tiến gần đến noãn hơn.
 
Tuy nhiên, các con đường tín hiệu và phân tử quy định cho sự hoạt hóa chức năng tinh trùng và phản ứng thể cực đầu chưa hoàn toàn được hiểu rõ. Do đó, nghiên cứu này được xây dựng để làm sáng tỏ thêm một số thay đổi liên quan đến proteomic của tinh trùng trong các giai đoạn thụ tinh khác nhau như khi xuất tinh, hoạt hóa chức năng, hay phản ứng thể cực đầu. Ngoài ra, những thay đổi proteomic này trên đối tượng tinh trùng bình thường (NZS) cũng được so sánh với nhóm đối tượng tinh trùng di động kém (AZS). Nhóm nghiên cứu tin rằng những phát hiện của nghiên cứu này sẽ nâng cao hiểu biết của chúng ta về các sự kiện phân tử và các protein liên quan điều chỉnh quá trình thụ tinh ở người.
 

2. Thiết kế nghiên cứu
2. 1. Thu thập và xử lý mẫu

Độ tuổi của những người tham gia nghiên cứu là từ 25 đến 40 tuổi. Mẫu tinh dịch được thu thập, đánh giá theo tiêu chuẩn WHO 2010, sau đó chia về 2 nhóm NZS và AZS. 15 mẫu (NZS = 3, AZS = 12) đã được thu thập và trước khi xử lý, 12 mẫu AZS được gộp vào 3 ống (4 mẫu trong mỗi ống).

1. 2. Chuẩn bị tinh trùng – ly tâm gradient tỷ trọng

Các mẫu tinh dịch được ly giải ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó, mẫu được lọc rửa theo phương pháp thang nồng độ không liên tục (gradient), ly tâm ở 500 g trong 30 phút, và rửa lại một lần với môi trường mới.

1. 3. Hoạt hóa chức năng in-vitro và phản ứng thể cực đầu

Tinh trùng được chức năng hóa in-vitro theo phương pháp của Chakravarty và cộng sự (2005) với một số sửa đổi.
2.4. Chiết xuất protein và phân cắt bằng trypsin
Mẫu tinh trùng sau mỗi bước lọc rửa, chức năng hóa, hay kích thích ly giải thể cực đầu đều sẽ được giữ lại để tiến hành phân tích proteomic. Phương pháp chuẩn bị mẫu có hỗ trợ lọc (FASP) được sử dụng để xử lý tinh trùng nhằm phân tích định lượng protein. Quá trình phân cắt protein bằng trypsin được thực hiện bằng cách ủ mẫu với 1µg trypsin ở 37◦C trong 16 giờ.

1. 4. Phân tích proteomic – sắc ký giấy, phân tích dữ liệu, tra cứu cơ sở dữ liệu để định danh protein, định lượng protein.

Phân tích proteomics được thực hiện như đã mô tả trước đây bởi Naglot S và cộng sự (2021).

1. 5. Phân tích thống kê và ứng dụng tin sinh học

Để xác định những thay đổi có ý nghĩa thống kê về proteomic, các phân tích thống kê đã được thực hiện trên MetaboAnalyst 5.0.
 

3. Kết quả

Nhìn chung, tổng cộng 1088 protein tinh trùng đã được xác định trong nghiên cứu. So với tinh trùng sau khi xuất tinh, 44 protein có mức biểu hiện khác biệt ở mẫu tinh trùng sau khi hoạt hóa, và 141 ở nhóm sau phản ứng thể cực đầu. Nhóm tác giả cũng tìm thấy một số lượng lớn protein điều hòa âm, bao gồm clusterin, PDHA1, semenogelin-1 & 2, HSP90, β-microseminoprotein và keratin. Nhóm kể trên được cho là các protein liên quan đến màng tinh trùng bị loại bỏ trong quá trình xâm nhập. Có sự thay đổi protein đáng kể giữa nhóm tinh trùng yếu (AZS) so với nhóm bình thường (NZS).
 

4. Kết luận

Các kết quả nghiên về sự thay đổi proteomic trong tinh trùng sau khi xuất tinh, hoạt hóa chức năng, khi phản ứng thể cực đầu, cũng như sự thay đổi của chúng trên nhóm NZS không chỉ góp phần nâng cao hiểu biết của chúng ta về tinh trùng ở góc độ phân tử mà còn là tiền đề cho các nghiên cứu mới giải mã những yếu tố vô sinh nam còn bỏ ngỏ.

Nguồn: Chhikara, Nirmal, et al. "Proteomic changes in human spermatozoa during in-vitro capacitation and acrosome reaction in normozoospermia and asthenozoospermia. " Andrology 11.1 (2023): 73-85.

Từ khóa: vô sinh nam, tinh trùng di động kém, proteomic