CVPH. Phạm Duy Tùng – IVFMD Tân Bình

Từ khi em bé đầu tiên ra đời nhờ công nghệ hỗ trợ sinh sản (HTSS) đến nay, có ít nhất 8 triệu em bé đã chào đời nhờ công nghệ này. Gần như hầu hết những em bé sinh ra nhờ HTSS đều khoẻ mạnh, nhưng vẫn còn đó những hoài nghi. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng HTSS có thể dẫn đến những ảnh hưởng tiêu cực lên thượng di truyền (epigenetic) và dẫn đến những bệnh lý hiếm liên quan đến quá trình in dấu di truyền. Chẳng hạn như hội chứng Beckwith- Wiedemann, hội chứng Angelman, hội chứng Silver-Russell và u nguyên bào mắt. Những dấu ấn di truyền này được điều khiển thông qua quá trình methyl hoá DNA, từ đó dẫn đến sự biểu hiện của các gen trên bộ nhiễm sắc thể.
 
Quá trình methyl hoá DNA hoạt động mạnh và phức tạp trong giai đoạn phát triển sớm của phôi. Sau khi khi hoàn tất quá trình thụ tinh, phôi sẽ trải qua quá trình khử methyl trên toàn bộ DNA trước khi thực hiện lại quá trình methyl hoá DNA khi phát triển đến giai đoạn phôi nang. Trong thụ tinh ống nghiệm, phôi được đánh giá hình thái để tiên lượng tiềm năng phát triển và làm tổ. Thông thường, phôi sẽ được lấy ra khỏi tủ cấy và đặt lên kính hiển vi để quan sát, điều này có thể tác động tiêu cực lên phôi do sự thay đổi các yếu tố về môi trường như nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng và nồng độ oxy. Những yếu tố này có thể ảnh hưởng đến quá trình methyl hoá của phôi, nhất là sự thay đổi về nồng độ oxy.
Với sự phát triển của công nghệ hình ảnh, các tủ nuôi cấy được trang bị máy ảnh để quan sát sự phát triển liên tục của phôi dưới dạng video tua nhanh thời gian (time-lapse imaging – TLI), giúp đánh giá sự phát triển của phôi trực tiếp trong tủ, giảm thiểu tác động của việc thay đổi môi trường khi lấy phôi ra khỏi tủ. Tuy nhiên, việc sử dụng ánh sáng để chụp hình phôi thường xuyên cũng là một vấn đề được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và cần có thêm các nghiên cứu về tác động của TLI đến sự phát triển của phôi. Trong nghiên cứu này, nhóm tập trung vào trạng thái methyl hoá của phôi 8 tế bào giữa nhóm nuôi cấy trong tủ thông thường và nhóm nuôi cấy trong tủ TLI. Từ đó tạo cơ sở để đánh giá tính an toàn của việc áp dụng TLI trong HTSS.
 
Phôi được hiến tặng bởi 9 phụ nữ, được tạo ra từ kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn với độ tuổi <30 (20-30 tuổi) và thoả các điều kiện sau: (1) hiếm muộn do tắc ống dẫn trứng, (2) số lượng noãn thu nhận được từ 10-15 noãn, có số phôi tốt trên 5, (3) nồng độ nội tiết tố trong pha nang noãn bình thường và (4) BMI dưới 25kg/m². Các tiêu chuẩn loại bao gồm bệnh nhân có bệnh lý di truyền hoặc hút thuốc, có hội chứng buồng trứng đa nang hoặc lạc nội mạc tử cung và cuối cùng là tiền sử rối loạn nội tiết. Sử dụng phương pháp kích thích buồng trứng với phác đồ downregulation, gây trưởng thành noãn bằng hCG, chọc hút noãn được thực hiện sau 36 giờ tiêm hCG và noãn được thực hiện tiêm tinh trùng vào bào tương sau 2 giờ sau chọc hút. Phôi được nuôi cấy ở điều kiện 5% O2, 6% CO2 ở cả 2 nhóm. Phôi sau đó được nuôi đến ngày 3, đánh giá theo đồng thuận của hiệp hội phôi học châu ÂU (ESHRE) và được xử lý để thu nhận DNA.
 
Tất cả phôi trong nghiên cứu đều được đánh giá chất lượng loại hai, với phân mảnh phôi từ 10-25%. Sử dụng công nghệ khuếch đại toàn bộ bộ gen bằng bisulfite, nhóm đánh giá được trạng thái methyl hoá ở cả 2 nhóm phôi nuôi trong 2 loại tủ cấy. Sau khi xử lý dữ liệu thô, tỷ lệ chuyển đổi trạng thái methyl thành kết quả sạch đạt 99,44% và đạt yêu cầu để có thể phân tích sâu hơn. Sử dụng phần mềm Bismask để so sánh với bộ gen người, hiệu quả so sánh đạt từ 29,4-34,1%. Các kết quả phân tích như sau:

• Về trạng thái methyl hoá chung, nhóm không nhận thấy sự khác biệt ở hai nhóm. Phôi ở cả 2 nhóm đều thể hiện các cấu trúc methyl hoá trên DNA tương tự nhau về mật độ CpG (cấu trúc gắn kết 2 nucleotide trên DNA), về mức độ phân bổ của sự methyl hoá trên vùng hoạt hoá (promoter). Điều này gợi ý cho việc mức độ dịch mã của cả hai nhóm cũng tương tự nhau. Nhóm cũng phân tích sâu hơn về sự methyl hoá đến biểu hiện gen và không ngoài dự đoán, mức độ methyl hoá vùng promoter tỷ lệ nghịch với sự biểu hiện của gen và tương tự ở cả 2 nhóm.
• Phân tích trạng thái methyl hoá của các yếu tố có khả năng chuyển vị cũng cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa 2 nhóm. Nhiều nghiên cứu trước đây cho thấy sự thay đổi trạng thái methyl hoá trên các yếu tố di truyền có khả năng thay đổi vị trí trên DNA đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của phôi. Những yếu tố được nhóm phân tích trong nghiên cứu bao gồm yếu tố trong họ retrovirus nội sinh (ERV), yếu tố long interspersed nuclear 1 (LINE-1) và L2, yếu tố Alu, yếu tố lặp lại ở động vật có vú (mammalian-wide interspersed repeats – MIRs).
• Trạng thái methyl hoá DNA ở các vùng in dấu. Mặc dù sau khi thụ tinh, phôi sẽ có quá trình khử methyl hoá toàn bộ, nhưng khu vực methyl hoá biệt hoá (differentially methylated regions - DMRs) được cho là sẽ giữ được trạng thái methyl hoá. Nhóm phân tích 25 dấu ấn DMRs, 21 đến từ mẹ và 4 đến từ bố. Nhóm nhận thấy không có sự khác biệt trong mức độ methyl hoá ở cả 2 nhóm cũng như không có sự khác biệt trong biểu hiện gen in dấu.
• Để chắc chắn không có sự khác biệt về trạng thai methyl hoá giữa 2 nhóm, nhóm nghiên cứu quyết định thực hiện so sánh trên các mẫu nhỏ hơn bằng cách kết hợp ngẫu nhiên các nhóm DMRs và cũng sử dụng phương pháp lựa chọn để giảm thiểu tỷ lệ dương tính giả. Nhóm xác định được 262 DMRs có độ tin cậy cao để so sánh, trong đó, 122 nhóm tăng biểu hiện và 140 nhóm giảm biểu hiện. Kết quả cho thấy cái DMRs này có khả năng phân biệt được phôi đến từ 2 nhóm tủ cấy khác nhau. Kết hợp với giải trình tự RNA, nhóm nhận thấy sự khác biệt trong mức độ biểu hiện gen của năm vùng DMRs ở 2 nhóm. Đáng chú ý nhất là sự biểu hiện xung quanh vùng Mad1, vùng đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự hình thành thoi vô sắc cho quá trình phân bào, mặc dù sự biểu hiện gen Mad1 ở cả 2 nhóm là tương tự nhau nhưng sự methyl hoá ở nhóm nuôi cấy trong tủ TLI cao hơn so với tủ thông thường.

 
Sự xuất hiện của tủ nuôi cấy liên tục TLI đã dẫn đến nhiều nghiên cứu nhằm so sánh hiệu quả của loại tủ mới so với tủ nuôi thông thường, tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có sự đồng thuận nào được đưa ra. Hầu hết các nghiên cứu đều so sánh về chất lượng phôi và tỷ lệ làm tổ và chưa có nghiên cứu nào thực hiện về sự khác biệt ở mức phân tử. Đây là nghiên cứu đầu tiên phân tích về sự khác biệt phân tử giữa 2 nhóm tủ cấy, cụ thể về trạng thái methyl hoá. Mặc dù không có sự khác biệt đáng kể nào được ghi nhận giữa 2 nhóm về trạng thái methyl hoá trên toàn bộ gen, nhóm vẫn xác định được có sự khác biệt rất nhỏ nằm trong các vùng biệt hoá nhưng không ảnh hưởng đến sự biểu hiện gen của phôi. Dữ liệu của nghiên cứu vẫn còn khá nhỏ và tỷ lệ khảo sát bộ gen vẫn còn hạn chế. Hơn nữa, sự khác biệt về trạng thái methyl hoá có thể được sửa chữa trong các giai đoạn phát triển sau của phôi hay không vẫn cần được nghiên cứu thêm trên giai đoạn phôi nang.
 
Nguồn: Zhu L, Zeng X, Liu W, Han W, Huang G, Li J. Comparison of DNA methylation profiles of human embryos cultured in either uninterrupted or interrupted incubators [published online ahead of print, 2022 Dec 2]. J Assist Reprod Genet. 2022;10.1007/s10815-022-02669-9. doi:10.1007/s10815-022-02669-9
 

Từ khóa: So sánh sự methyl hóa DNA trên phôi khi nuôi cấy liên tục và không liên tục