CNSH. Hà Thị Diễm Uyên - IVFMDSIH - Bệnh viện Phụ sản Quốc tế Sài Gòn
 
HIỆN TẠI
2004–2019: tích hợp các quy trình thủy tinh hóa và sinh thiết TE
Nhóm de Boer và McArthur của Úc (2004 và 2005) đã xuất bản hai bài báo quan trọng trình bày chi tiết về quy trình sinh thiết phôi nang, ngày nay được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới: phương pháp ''sinh thiết TE dựa trên mở lỗ ZP ngày 3''. Toàn bộ quy trình như sau: mở lỗ ZP vào ngày 3, nuôi cấy phôi nang (ngày 5-6), sinh thiết TE (5-6 tế bào) ở phía đối diện ICM, trữ lạnh và sau đó rã đông phôi nguyên bội để chuyển. Việc mở lỗ ZP có thể được thực hiện thông qua 3 cách: cơ học, acid Tyrode hoặc laser, trong đó quy trình sử dụng tia laser thân thiện với người dùng nhất. Với chiến lược thu nhận tế bào TE, có 2 cách: phương pháp "pulling" và "flicking". Cụ thể, phương pháp "pulling" lý tưởng cho các phôi nang đã thoát màng một phần, trong khi phương pháp "flicking" thích hợp hơn cho các phôi đã thoát màng hoàn toàn. "Pulling" là phương pháp cắt đứt các tế bào TE ra phần còn lại của phôi nang bằng vài tia laser bắn vào các cầu nối giữa tế bào; Theo phương pháp "flicking", sau khi nới lỏng liên kết giữa các tế bào TE đã chọn với phần còn lại của phôi nang thông qua các tia laser, phôi được giải phóng khỏi holding pipet và di chuyển đến vành của holding, sau đó kéo mạnh xuống dưới và cuối cùng pipette sinh thiết tách được các tế bào đã chọn. Tuy nhiên, hiện tại, chưa có nghiên cứu nào so sánh hai phương pháp trên để thu nhận tế bào TE; do đó, những nghiên cứu như vậy đang được háo hức chờ đợi. Sau đó, nhóm người Úc đã vạch ra một quy trình làm việc hiệu quả bằng cách kết hợp sinh thiết phôi nang với chuyển đơn phôi đông lạnh-rã đông (2013).
 
Thủy tinh hóa phôi nang sau sinh thiết và sinh thiết phôi nang đã được rã đông: những kinh nghiệm đầu tiên
Parriego (2007) đã báo cáo 1 ca sinh sống sau khi chuyển phôi nang sinh thiết đã được trữ lạnh - rã đông bằng thủy tinh hóa. Lathi và Behr (2009) đưa ra quy trình rã đông các phôi chưa được xét nghiệm di truyền, sau đó sinh thiết TE, phân tích di truyền và chuyển phôi trong cùng ngày. Đây là lựa chọn cho trung tâm có phòng thí nghiệm di truyền nội bộ và sử dụng các chẩn đoán có kết quả trong thời gian ngắn. Nhìn chung, sinh thiết phôi và trữ lạnh có mối quan hệ chặt chẽ với nhau, do đó một chương trình nuôi cấy phôi nang và thủy tinh hóa hiệu quả rõ ràng là rất cần thiết để thực hiện PGT tại một trung tâm IVF.
 
Hai nghiên cứu quan trọng trong lịch sử PGT: Sinh thiết TE an toàn và hiệu quả hơn sinh thiết phôi bào
Scott (2012 và 2013) đã công bố 2 nghiên cứu quan trọng trong lịch sử sinh thiết phôi. Họ đã cung cấp cho cộng đồng khoa học dữ liệu hạng nhất nêu bật tính ưu việt của sinh thiết TE so với sinh thiết phôi bào. Tuy nhiên, cần có nhiều nghiên cứu hơn với kích thước mẫu lớn hơn, cách tiếp cận sinh thiết phôi bào ít xâm lấn hơn, ở các quần thể BN khác nhau và từ các trung tâm IVF khác để xác nhận liệu sinh thiết phôi bào có thực sự gây bất lợi cho khả năng phát triển của phôi hay không. Trên thực tế, một RCT gần đây cho thấy kết quả tốt hơn ở nhóm PGT so với nhóm chứng trên BN lớn tuổi, ngay cả khi sinh thiết phôi bào và thực hiện a-CGH.
 
Hoàn thiện và tiêu chuẩn hóa phương pháp sinh thiết phôi nang để đáp ứng nhu cầu của một trung tâm IVF hiện đại
Capalbo (2014) đã mô tả quy trình sinh thiết phôi nang thứ ba và cũng là cuối cùng được công bố cho đến nay: phương pháp "mở lỗ ZP và sau đó sinh thiết TE". Khác với 2 quy trình còn lại, đòi hỏi mở lỗ ZP vào ngày 3 (thậm chí ngày 4) hoặc vào ngày 5-6 ngay khi phôi đạt đến giai đoạn phôi nang nở rộng hoàn toàn, chiến lược thứ ba này không cần bất kỳ quá trình hỗ trợ thoát màng nào. Phôi nang được gắn vào holding pipette, mở lỗ ZP bằng laser ở đối diện ICM và sau đó tách TE ra khỏi phần bên trong ZP bằng cách thổi nhẹ một ít môi trường qua lỗ. Các phôi nang bắt đầu sụp ngay sau đó; Người thực hiện đưa pipette sinh thiết qua lỗ trong ZP, hút khoảng 5 tế bào vào pipette và bắt đầu di chuyển ngược lại. Khi các tế bào TE đã chọn nằm ngoài ZP, người thực hiện chiếu tia laser và bắn vào các điểm cầu nối giữa các tế bào để thu nhận tế bào.
 
Hiện tại, phương pháp sinh thiết phôi nang dựa trên sự hỗ trợ mở lỗ sáng ngày 5-6 là một chiến lược tốt cho những người mới bắt đầu với kinh nghiệm vi thao tác phôi còn hạn chế. Tuy nhiên, nó không phù hợp với một trung tâm IVF bận rộn phải tiến hành nhiều quy trình sinh thiết mỗi ngày do phải dựa vào thời gian phôi thoát màng từ khi mở lỗ trong ZP, thời gian này là không thể đoán trước. Quy trình hỗ trợ mở lỗ vào ngày 3 có một số nhược điểm như sau: tạo stress phôi ở giai đoạn phân cắt; một số phôi có thể không đạt đến giai đoạn phôi nang; nguy cơ thoát màng tại ICM; khó khăn trong sắp xếp khối lượng công việc hàng ngày để tránh rủi ro phôi nang thoát màng hoàn toàn; và ảnh hưởng đến quá trình mở rộng khoang phôi cũng như thoát màng.
 
Một số nghiên cứu đã được thực hiện trong 5 năm qua nhằm tiêu chuẩn hóa kĩ thuật sinh thiết phôi nang và các kết quả của nó. Capalbo (2016) đã báo cáo kết quả về kỹ thuật và lâm sàng của gần 2600 chu kì sinh thiết TE bằng phân tích qPCR trên 7 chuyên viên phôi học đã trải qua khóa đào tạo giống nhau từ 3 trung tâm IVF. Trong bài báo này, họ đã báo cáo kết quả đồng nhất và khả năng lặp lại về mẫu qPCR, số lượng tế bào sinh thiết, thai sinh hóa, sẩy thai và tỷ lệ thai diễn tiến, thậm chí so sánh với người thực hiện nhiều kinh nghiệm so với người ít kinh nghiệm nhất. Một nghiên cứu tương tự với gần 9000 quy trình sinh thiết TE được tiến hành tại 6 trung tâm IVF để xác định nguy cơ sinh thiết lại và lý do kết quả qPCR không thể kết luận. Trong đó, nguy cơ sinh thiết lại là 2,5%; trong đó 2% có liên quan dẫn đến lỗi khuếch đại DNA và 0,5% đối với mẫu chất lượng thấp. Đáng chú ý, chất lượng phôi nang không liên quan đến nguy cơ sinh thiết lại, trong khi ngày làm sinh thiết và trung tâm IVF cho thấy mối liên quan đáng kể. Đặc biệt, thời gian sinh thiết sớm (tức là phôi nang ít giãn nở hơn, cũng như các tế bào ít và to hơn tạo thành toàn bộ TE vào ngày thứ 5 so với ngày thứ 6-7) và chuyên môn kém hơn nếu không được đào tạo nghiêm ngặt có thể tăng gấp đôi nguy cơ kết quả chẩn đoán không thể kết luận (5%).
 
Tuy nhiên, tất cả các nghiên cứu đều thống nhất khi khẳng định rằng quy trình trữ rã và sinh thiết lần thứ hai không gây bất lợi cho các chuyên gia sinh thiết. Neal (2017) báo cáo khi số lượng tế bào lấy ra <15, sinh thiết TE không ảnh hưởng đến kết quả lâm sàng. Tuy nhiên, cần phải có thêm nhiều nghiên cứu đặc biệt để mô hình hóa số lượng tế bào lấy liên quan đến sự nở rộng phôi nang, số lượng tế bào cấu thành phần còn lại của phôi nang và chất lượng hình thái phôi.
 
Sinh thiết TE cho thấy khi sụp khoang phôi nang bằng laser (cả trong chu kỳ không PGT hoặc chu kỳ PGT sinh thiết khoảng năm tế bào) có lợi trong việc hạn chế sự thoái hóa của phôi sau quá trình trữ-rã. Thời gian lý tưởng để thực hiện sinh thiết TE đã được trình bày bởi Maggiulli (2019), tốt nhất nên ngắn hơn 30 phút và tối đa 90 phút, giữa thời gian sinh thiết và thủy tinh hóa. Mục đích để hạn chế nguy cơ phôi nang nở lại trước khi bắt đầu quy trình trữ lạnh.
 
Một vấn đề khác là chất lượng phôi nang có thể được sử dụng quy trình sinh thiết TE. Alfarawati (2011) đã báo cáo tỷ lệ nguyên bội thấp hơn ở các phôi có chất lượng hình thái kém hơn. Sau đó, Capalbo (2014) đã xác nhận mối liên hệ nhẹ giữa tỷ lệ nguyên bội với chất lượng phôi, mặc dù khi chuyển phôi nguyên bội không có sự khác biệt đáng kể nào về sự thành công của quá trình làm tổ liên quan đến hình thái. Gần đây, 1 nghiên cứu lớn hơn (2019) tập trung vào sự khác biệt giữa phôi nang chất lượng kém (poor quality blastocysts  - PQBs; <BB theo phân loại của Gardner và Schoolcraft) và không phải PQBs trong chu kỳ PGT-A. Tỷ lệ nguyên bội và tỷ lệ sinh sống sau chuyển phôi nguyên bội thấp hơn nhưng sử dụng PQBs giúp tỷ lệ sinh sống tăng 2,5% trên mỗi chu kỳ và thậm chí tăng 5% ở phụ nữ >42 tuổi, khi PQBs chiếm hơn 30% số phôi nang được tạo ra sau thụ tinh ống nghiệm. Do đó những phôi này cũng không nên bỏ qua để sử dụng trong lâm sàng, đặc biệt là ở những BN có tiên lượng xấu. Kết luận tương tự cho các phôi nang ở ngày 7 bởi Hammond (2018) cho thấy, việc nuôi cấy thêm 1 ngày nữa sẽ có giá trị tăng tỷ lệ sinh sống tích lũy trên mỗi chu kỳ, đặc biệt ở những BN có tiên lượng xấu.
 
Một bước tiến quan trọng cuối cùng trong lịch sử hiện tại của sinh thiết phôi nang năm 2016 và 2017 về quy trình qPCR kết hợp a-CGH để tiến hành xét nghiệm lệch bội và chẩn đoán bệnh di truyền đơn gen khi chỉ cần 1 lần sinh thiết TE, ở các cặp vợ chồng có chỉ định cho cả PGT-A và PGT-M.
 
Cuối cùng, Natsuaki và Dimler (2018) đã xuất bản một phân tích tổng hợp báo cáo điều tra kết quả sơ sinh sau PGT cho thấy bất kể giai đoạn và phương pháp sinh thiết nào được áp dụng, PGT đều không ảnh hưởng đến kết quả sơ sinh và sau sinh, do đó trấn an cộng đồng khoa học về tính an toàn của các phương pháp được sử dụng cho đến nay.
 
TƯƠNG LAI
Các phương pháp thay thế: cơ sở lý luận, các báo cáo đầu tiên và các vấn đề chính
Blastocentesis
BF (blastocoel fluid - dịch khoang phôi nang) đã được đề xuất như một nguồn DNA thay thế để tiến hành PGT. Một kỹ thuật xâm lấn tối thiểu (gọi là blastocentesis) được thiết lập để lấy DNA tự do có thể được giải phóng vào khoang phôi nang người. Blastocentesis được thực hiện bằng cách hút khoảng 1 μl BF từ phôi nang đã mở rộng bằng kim ICSI, tránh hút vật liệu tế bào có thể ảnh hưởng đến kết quả. Mặc dù là một kỹ thuật đầy hứa hẹn, nhưng số lượng và tính toàn vẹn của DNA được tìm thấy trong BF vẫn không thể xác định được, vì nguồn gốc của DNA một phần từ các tế bào trải qua necrosis hoặc apoptosis. Trên thực tế, tỷ lệ khuếch đại (56% –82%) cũng như tỷ lệ đồng nhất của blastocentesis với TE tương ứng (37% –97%) khác nhau đáng kể giữa các nghiên cứu được công bố cho đến nay.
 
Sinh thiết phôi dâu
Sinh thiết phôi dâu về mặt kỹ thuật tương tự như sinh thiết phôi bào, nhưng liên quan đến số lượng tế bào được lấy ra tương đối nhiều hơn. Ngoài ra, vì sinh thiết được thực hiện vào ngày 4 nên có đủ thời gian để thực hiện xét nghiệm NST và chuyển phôi tươi. Nghiên cứu đầu tiên khẳng định tính khả thi của sinh thiết phôi dâu ở người được công bố vào 2014. Tuy nhiên cách này đặt ra mối quan tâm về sử dụng môi trường không có Ca²⁺ / Mg²⁺ - để nới lỏng sự nén chặt. Nguyên nhân có thể có các vấn đề về số phận tế bào được thiết lập khi lấy ra từ giai đoạn phát triển tiền làm tổ quan trọng và nhạy cảm như vậy. Do đó, quy trình sinh thiết này vẫn nên được coi là thử nghiệm, đặc biệt là do thiếu dữ liệu từ các trung tâm IVF khác xác nhận khả năng lặp lại và tính an toàn của nó.
 
Sinh thiết nghiên cứu thể khảm: mối liên hệ giữa phôi học và sinh học phân tử
Thể khảm là sự hiện diện của hai hoặc nhiều dòng tế bào khác biệt về mặt di truyền trong một sinh vật gây ra bởi lỗi phân ly trong nguyên phân hoặc đột biến DNA trong giai đoạn phát triển sau hợp tử. Mặc dù thể khảm thực sự được chẩn đoán ở <1% số mẫu trước sinh và ước tính <0,2% trẻ sinh sống, việc đánh giá tỷ lệ khảm trong các giai đoạn tiền làm tổ đã cho kết quả không nhất quán, dao động trong khoảng từ 2% - 90%. Hiện tại, không có phương pháp khách quan để đánh giá tỷ lệ khảm thực sự ở phôi người do có thể bị ảnh hưởng ở nhiều cấp độ như hạn chế về kỹ thuật và sinh học, phân loại đa dạng tùy thuộc vào mức độ nghiêm ngặt của các tiêu chí được sử dụng cho phân tích.
 
Tương lai
PGT không xâm lấn: có thể thành hiện thực?
Các phương pháp sinh thiết đòi hỏi kỹ năng và chuyên môn, thiết bị chuyên dụng và đắt tiền. Do đó giới hạn trong việc triển khai sinh thiết trên thế giới. Vì vậy, một số nhóm đã bắt đầu nghiên cứu các chiến lược không xâm lấn để phân tích DNA tự do từ phôi trong môi trường nuôi cấy và báo cáo tỷ lệ khuếch đại DNA từ môi trường dao động từ 80% - 100%, nhưng tỉ lệ đồng nhất với TE rất đa dạng. Rubio (2019) đã thiết lập quy trình hạn chế sự can thiệp, chỉ thay môi trường vào ngày 4 sau thụ tinh và kết quả là tỷ lệ khuếch đại cao tới 94% và tỷ lệ đồng nhất với sinh thiết TE cao tới 84% khi phôi được nuôi cấy trong ít nhất 48 giờ.
Gần đây hơn, 3 nhóm độc lập đã thiết lập quy trình gây sụp khoang phôi nang trong giọt môi trường khi phôi được nuôi cấy cho phép thu thập và phân tích mẫu là kết quả của sự kết hợp giữa BF và môi trường phôi nang đã sử dụng (spent blastocyst media – SBM). Kết quả đạt được với thiết kế nghiên cứu này được so sánh với cả sinh thiết TE và toàn bộ phôi nang tương ứng, đưa ra bằng chứng rất hứa hẹn. Phân tích kết hợp BF và SBM thể hiện viễn cảnh tương lai thú vị; tuy nhiên, cần bộ vi thao tác và phải xâm lấn tối thiểu. Ngược lại, nếu bản thân SBM đủ để cung cấp thông tin tiên lượng có giá trị về mặt lâm sàng, thì quan điểm mang tính cách mạng của nó chắc chắn rộng hơn. Do đó, xu hướng PGT không xâm lấn là rất tiềm năng vì sẽ giảm thiểu chi phí, áp dụng được cho nhiều phòng lab và tăng khả năng tiếp cận với đông đảo BN hơn. Cuối cùng, BF và SBM cũng có thể được thực hiện phân tích 'omic' để có thêm thông tin phân tử mà trong tương lai có thể được sử dụng để cải thiện chọn lựa phôi.
PGT cho phôi nang in vivo: có phải là một thực hành hợp lý trong tương lai để xem xét?
Gần đây, Munnè (2020) công bố nghiên cứu cho rằng PGT có thể thực hiện trên phôi nang được thu nhận trực tiếp từ tử cung sau khi IUI thông qua rửa tử cung. Tuy nhiên nghiên cứu này liên quan đến bốn giới luật của Y học có thể đã bị vi phạm và cần các nghiên cứu trong tương lai để xác định liệu PGT sử dụng phôi nang in vivo có được coi là cách tiếp cận hợp lý trong IVF hay không.
 
SƠ LƯỢC VỀ ĐẠO ĐỨC CỦA SINH THIẾT PHÔI VÀ PGT
Sinh thiết phôi và PGT nêu ra các vấn đề đạo đức liên quan như sự khác biệt giữa phôi so với con người và nỗi sợ hãi về thuyết ưu sinh. Khi nào cuộc sống bắt đầu? Khi nào chúng ta nên công nhận ''nhân quyền đầy đủ''? Cuộc tranh luận về phôi xuất phát từ giả thuyết rằng nó có thể trở thành một con người, mặc dù về xác suất hầu hết các phôi thậm chí không dẫn tới mang thai. Điều này làm dấy lên những câu hỏi đạo đức về giá trị của một con người, sự tôn trọng phôi và quyền tự quyết, tất cả đều được đề cập đến thực hành liên quan đến thụ tinh ống nghiệm. Ngoài ra còn mối quan tâm quan trọng: nguy cơ sinh thiết có thể gây bất lợi cho phôi; và nguy cơ của thuyết ưu sinh. Tuy nhiên, cho đến nay, không có bằng chứng chắc chắn nào chứng minh tác động bất lợi của sinh thiết lên phôi. Thay vào đó, đối với thuyết ưu sinh, hiện tại, về mặt kỹ thuật là không khả thi. Và dù vậy, PGT không nhằm mục đích lựa chọn bất kỳ đặc điểm thuận lợi nào, nó chỉ là một phân tích nhằm xác định tình trạng sức khỏe của phôi để hạn chế các bệnh di truyền nghiêm trọng, giảm nguy cơ sẩy thai và các hội chứng NST ở trẻ sơ sinh.
 
KẾT LUẬN
Trong giai đoạn đầu của sinh thiết phôi, các nhà phôi học lâm sàng đã phải miễn cưỡng thực hiện các quy trình vi thao tác xâm lấn để sinh thiết các tế bào, và có thể gây thêm tổn thương cho phôi. Tuy nhiên, trong bối cảnh một cặp vợ chồng cố gắng sinh con không bị bệnh di truyền, phôi không thể được chuyển trừ khi nó được sinh thiết và xét nghiệm, do đó rủi ro của phôi được cân bằng với lợi ích của xét nghiệm. Bằng sự cẩn thận, ngay cả các quy trình đầu tiên sinh thiết giai đoạn phân cắt cũng cho tỷ lệ mang thai tương đương với IVF nói chung. Tuy nhiên, sinh thiết nhiều hơn một tế bào từ phôi 6 - 10 tế bào làm giảm tỷ lệ có thai. Câu hỏi quan trọng hơn là: liệu việc sinh thiết này có gây ra bất thường cho thai nhi sau khi chuyển không? Theo dõi thai kỳ và trẻ sinh sống sau sinh thiết và PGT đã trở thành ưu tiên hàng đầu của ESHRE PGT Consortium, và sau một số năm, một số bài báo đánh giá hàng loạt trường hợp thường yên tâm rằng không có sự gia tăng các bất thường thai nhi hoặc dị tật bẩm sinh.
Câu chuyện 30 năm về cuộc cách mạng sinh thiết phôi vẫn tiếp tục phát triển. Việc phôi có thể được xét nghiệm bằng cách kiểm tra các đại phân tử trong môi trường nuôi cấy có tiềm năng cách mạng hóa hoàn toàn phôi học lâm sàng bằng cách loại bỏ các quy trình tốn nhân lực và vi thao tác xâm lấn. Các phương pháp không xâm lấn này có hiệu quả như thế nào về hiệu quả và độ chính xác vẫn còn đang được nghiên cứu. Vì vậy các phương pháp sinh thiết xâm lấn vẫn tiếp tục được thực hiện để có độ chính xác cao nhất và sự ảnh hưởng đến phát triển của phôi chỉ là thứ yếu khi mục đích chính là phòng ngừa bệnh di truyền nghiêm trọng.
 
Tài liệu tham khảo: Danilo Cimadomo, Laura Rienzi, Antonio Capalbo, Carmen Rubio, Federica Innocenti, Carmen María García-Pascual, Filippo Maria Ubaldi, Alan Handyside, The dawn of the future: 30 years from the first biopsy of a human embryo. The detailed history of an ongoing revolution, Human Reproduction Update, Volume 26, Issue 4, July-August 2020, Pages 453–473.

Xem lại Phần 1

Từ khóa: Lịch sử chi tiết 30 năm của cuộc cách mạng sinh thiết phôi: hiện tại và tương lai (Phần 2)