CNSH. Phạm Duy Tùng – IVFMD Tân Bình

Kỹ thuật đông lạnh bằng phương pháp thuỷ tinh hoá là một trong những kỹ thuật thiết yếu tại các đơn vị hỗ trợ sinh sản, đưa tế bào về nhiệt độ thấp và tồn tại ở trạng thái tiềm sinh. Kỹ thuật này bao gồm việc đông lạnh và rã đông ở tốc độ cực cao nhằm mục đích chuyển toàn bộ vật chất trong tế bào trực tiếp từ thể lỏng sang thể rắn giúp bảo tồn cấu trúc và chức năng của tế bào. Điều này giúp hạn chế tình trạng hình thành các tinh thể đá của nước có thể làm tổn thương hoặc gây chết cho tế bào. Sự thành công của quá trình thuỷ tinh hoá phụ thuộc vào tốc độ làm lạnh và rã đông, khuynh hướng hình thành thuỷ tinh của môi trường (phụ thuộc vào nồng độ và độ nhớt của dung dịch).
Hiện nay, trong các labo phôi học, noãn và phôi được trữ lạnh và rã đông ở các tốc độ trao đổi nhiệt khác nhau phụ thuộc vào loại môi trường và vật chứa được thiết kế bởi các nhà sản xuất. Tuy nhiên, kích thước và lượng nước trong noãn và phôi lớn nên khó có thể đạt được tốc độ làm lạnh như nhà sản xuất đề ra (không như tinh trùng). Vì vậy, noãn và phôi cần phải trải qua quá trình chuẩn bị trước khi đông lạnh, trong đó nước sẽ được thay thế bằng các chất bảo vệ đông lạnh (CPA), làm tăng nồng độ chất tan trong tế bào từ đó giảm sự hình thành tinh thể đá trong cả quá trình đông lạnh và rã đông sau này. Quy trình chuẩn bị thường giống nhau dù có sử dụng vật chứa phôi nào đi nữa và thường bao gồm 2 hoặc nhiều giai đoạn tiếp xúc với các môi trường có chứa CPA thẩm thấu và không thẩm thấu. Các chất này tuy giúp bảo vệ tế bào trong quá trình trữ lạnh và rã đông nhưng bản thân chúng cũng gây độc cho tế bào phụ thuộc vào nồng độ và thời gian tiếp xúc.

Trữ lạnh và rã đông phôi được thực hiện trong thời gian rất ngắn nhưng thời gian của cả quy trình tương đối tốn thời gian (8-15 phút tuỳ giai đoạn phát triển của phôi) chủ yếu do quá trình trao đổi cân bằng trong môi trường trữ đông phôi, mặc dù, đã có một số quy trình ngắn hơn đã được đề xuất. Do đó, việc rút ngắn thời gian là điều nhiều chuyên viên phôi học mong muốn và nó cũng giúp tối ưu quy trình trong IVF, đồng thời cũng có lợi cho phôi khi giảm được thời gian ở trong môi trường có nhiệt độ và áp suất thẩm thấu không tối ưu. Nghiên cứu này sử dụng máy tính (in silico) trên mô hình thẩm thấu sinh học của noãn và quan sát quá trình thẩm thấu in vitro và đưa ra quy trình chuẩn bị noãn và hợp tử ngắn hơn so với quy trình chuẩn. Sử dụng các CPA tiêu chuẩn, nghiên cứu đưa ra quy trình khử nước (dehydration protocol - DP) giúp giảm thời gian trong môi trường cân bằng xuống chỉ còn 2 phút. Sau đó, so sánh giữa 2 quy trình chuẩn bị và đánh giá hiệu quả trên noãn và hợp tử bất thường được hiến tặng cho nghiên cứu.

Phương pháp:
Để xây dựng mô hình sinh lý của noãn và xác định tính khả thi của phương pháp khử nước, nghiên cứu sử dụng đặc tính thẩm thấu của noãn/hợp tử được trình bày trong các nghiên cứu trước nhằm giảm thiểu số lượng noãn và hợp tử cần phải sử dụng. Sau đó, nhóm sẽ xác nhận lại những dự đoán này bằng cách quan sát quá trình thẩm thấu của noãn MII được hiến tặng cho nghiên cứu. Noãn được sử dụng là những noãn không thụ tinh hoặc những noãn thụ tinh bất thường có nhiều hơn 2 tiền nhân khi kiểm tra thụ tinh. Để đảm bảo độ chính xác, nghiên cứu được thực hiện trên 30 noãn và 27 hợp tử.

Noãn được chuẩn bị bằng 2 phương pháp:

• Phương pháp cân bằng (equilibration protocol) - EP: noãn sẽ được tiếp xúc trực tiếp với môi trường không thủy tinh hóa (non-vitrifying solution – nVS) (7,5% v/v Me2SO & 7,5% v/v EG; 1,06 mol/L Me2 SO & 1,12 mol/L EG với đệm PBS) trong vòng 10 phút. Sau đó, được chuyển vào môi trường thủy tinh hóa (vitrifying solution – VS) (15% v/v Me2 SO, 15% v/v EG and 0,5 M sucrose; 2,11 mol/L Me2SO & 2,69 mol/L EG với đệm PBS) trong 1 phút.
• Phương pháp khử nước (dehydration protocol) – DP: noãn sẽ được tiếp xúc lần lượt với môi trường nVS sau đó đến VS với thời gian 1 phút trong mỗi loại môi trường.

Quy trình trữ lạnh:
Noãn và hợp tử được trữ lạnh bằng dụng cụ trữ kín của Safepreservation (Tây Ban Nha). Quá trình chuyển noãn lên dụng cụ trữ, đậy nắp và làm lạnh được thực hiện trong vòng 60 giây kể từ khi tiếp xúc với VS.
Khi rã đông, dụng cụ trữ được chuyển vào bể nước 37⁰C trong 2 giây, lau khô, cắt bỏ phần đầu có chứa noãn vào môi trường sucrose 1M trong 60 giây. Sau đó noãn được chuyển vào sucrose 0,5M trong 3 phút và cuối cùng là 5 phút trong môi trường không có CPA. Theo các nghiên cứu trước đó, với dụng cụ này tốc độ rã đông có thể đạt 200.000⁰C/phút.
Mô hình khuếch tán ở noãn MII:
Mô hình khuếch tán được xây dựng theo công thức vận chuyển 2 thông số để thực hiện các mô phỏng quá trình trao đổi CPA thẩm thấu và không thẩm thấu ở noãn. Sử dụng các công thức toán học để dự đoán tốc độ trao đổi của nước và chất tan thông qua màng tế bào bằng phần mềm MATLAB, với giả định noãn có đường kính 63µm và thể tích không chứa chất tan của noãn là 19% so với thể tích ban đầu. Các thông số về khả năng xuyên màng của nước và CPA cũng như năng lượng dùng để vận chuyển chung được sử dụng dựa theo những ước lượng từ các nghiên cứu trước đây.
Một số yếu tố được giản lược cho quá trình mô phỏng:

• Noãn ở hình cầu hoàn hảo trong quá trình co lại và phục hồi.
• Nồng độ chất tan không bị ảnh hưởng khi chuyển noãn giữa các môi trường
• Không có áp suất của nước
• Các yếu tố thẩm thấu khác đều có hệ số thẩm thấu là 1 trừ NaCl.

Mô phỏng được chạy với phương pháp EP và DP và so sánh tỷ lệ sống sau rã, tỷ lệ nước và chất tan trong noãn trong thời gian chuẩn đối với EP (10 phút nVS và 1 phút VS), còn đối với DP là trong giới hạn 1 phút với cả nVS và VS.

Quan sát quá trình thẩm thấu của noãn in vitro:
Để xác định kết quả của mô hình dự đoán là chính xác, nhóm nghiên cứu tiến hành thực nghiệm trên noãn để quan sát quá trình thẩm thấu của noãn ở từng phương pháp.

Chuẩn bị CPA:
Đĩa petri 60mm được chuẩn bị với 3 giọt môi trường, 2µL PBS, 200µL nVS và 2ml VS được đặt gần nhau trên bề mặt được kiểm soát ở 25⁰C dưới kính hiển vi đảo ngược có hệ thống vi thao tác. Để giảm thiểu sự bay hơi, thời gian di chuyển noãn giữa các môi trường là tối thiểu. Sử dụng một dụng cụ mảnh, giọt PBS và giọt nVS được hòa với nhau để bắt đầu quá trình thẩm thấu, sau khi hoàn tất thời gian trong nVS, giọt này sẽ được hòa vào giọt VS. Quá trình thực hiện sẽ được ghi nhận bằng phần mềm máy tính ở độ phóng đại X400. Hình ảnh được ghi nhận sau mỗi 10 giây trong 60 giây đầu tiên ở DS1 và DS2, và mỗi 60 giây sau đó trong vòng 10 phút sau DS1 để xác định sự thay đổi về thể tích. Hình ảnh tĩnh được dùng để xác định diện tích và tính toán ra thể tích. Để trảnh ảnh hưởng của sự thay đổi hình dạng noãn trong quá trình co lại, đường kính được tính dựa trên hình ảnh 2 chiều của noãn và giả định noãn được duy trì ở dạng cầu trong suốt quá trình trữ lạnh.

Tỷ lệ sống của noãn và hợp tử sau quá trình khử nước DP.
Tỷ lệ sống của noãn và hợp tử được đánh giá sau 2 giờ sau rã đông và phục hồi nước cho tế bào. Noãn được xác định là sống khi có dạng hình cầu như trước khi trữ đông. Đối với hợp tử sẽ được nuôi thêm trong 24 giờ để có thể tiếp tục phân chia và so sánh với nhóm hợp tử bất thường đối chứng không qua trữ đông.

Kết quả:
Phân tích kết quả in silico. Dự đoán tương quan giữa thể tích và nồng độ chất tan trong noãn tương ứng với 2 phương pháp, phương pháp EP và phương pháp DP.
Trong cả 2 phương pháp, mô hình dự đoán sau khi tiếp xúc với nVS noãn sẽ co lại đến kích thước nhỏ nhất (44,8%) sau 29,4 giây. Do thời gian ở trong nVS của nhóm DP chỉ là 1 phút do đó sự cân bằng gần như chưa xảy ra, với thể tích noãn đạt 48,6%. Ở nhóm EP, noãn có 10 phút ở trong nVS do có sự cân bằng diễn ra nên noãn đạt kích thước 79,4% so với ban đầu. Nồng độ chất tan nội bào gần như tương tự nhau dù thời gian tiếp xúc với nVS là khác nhau.
Khi cho vào môi trường VS, mô hình cho thấy noãn nhóm EP co lại còn 49,9% thể tích ban đầu sau 1 phút, còn ở nhóm DP với thời gian ở trong nVS ngắn hơn được dự đoán sẽ co lại còn 39,2% thể tích ban đầu. Tổng nồng độ chất tan nội bào ở cả 2 nhóm là tương đương nhau (EP: 5,40 mol/L và DP: 5,37 mol/L). Tuy nhiên có sự khác biệt về nồng độ CPA thẩm thấu (Me₂SO và EG) cũng như thể tích nước nội bào. Cụ thể nhóm EP có nồng độ CPA và thể tích nước nội bào cao hơn so với nhóm DP (92,5% so với 88,5% và 26,6 so với 17,7).

Quan sát sự thẩm thấu in vitro
Quan sát sự phản ứng của noãn khi tiếp xúc với nVS và VS trong quy trình EP và DP. Noãn được chuyển từ môi trường nuôi cấy đẳng trương với áp suất thẩm thấu 290 mOsmol và được cho trực tiếp vào môi trường nVS có áp suất thẩm thấu cao (2910 mOsmol). Sự thay đổi áp suất thẩm thấu này khiến noãn thay đổi về thể tích (noãn co lại chỉ còn 60% so khi ở môi trường nVS), thời gian co lại lâu hơn so với dự đoán, từ 40 đến 60 giây ở cả 2 nhóm, nguyên nhân có thể do sự pha loãng môi trường trong khi thao tác.  Noãn phục hồi đến 77% thể tích so với ban đầu ở nhóm EP trong khi nhóm DP chỉ đạt mức 61% sau 1 phút nằm trong nVS.

Noãn sau đó được chuyển vào môi trường VS (7068 mOsmol). Áp suất thẩm thấu cao tiếp tục khiến tế bào co lại, ở nhóm EP là 67% và nhóm DP là 52%.

Tỷ lệ sống của noãn và hợp tử sau quá trình đông lạnh và rã đông bằng phương pháp khử nước DP.
Tất cả noãn và hợp tử trong nghiên cứu được thủy tinh hóa với phương pháp DP đều sống (30/30 với noãn và 27/27 với hợp tử). Tỷ lệ sống của noãn nằm trong khoảng chấp nhận được khi so sánh với tỷ lệ 95% ở nhóm noãn được đông lạnh bằng phương pháp thông thường (dựa trên các đồng thuận gần đây). Trong 27 noãn thụ tinh 3PN được trữ đông bằng DP, 24 trong số đó tiếp tục phát triền và phân chia sau 24 giờ nuôi cấy, so với 25/27 ở nhóm 3PN được sử dụng làm đối chứng.

Như vậy, nghiên cứu cho thấy noãn và hợp tử bất thường được trữ đông bằng phương pháp EP hay DP đều có nồng độ chất tan trong tế bào phù hợp để thực hiện đông lạnh mặc dù vẫn có những khác biệt về nồng độ CPA và nồng độ nước trong tế bào của từng phương pháp. Sự khác biệt này có thể làm ảnh hưởng đến quá trình hình thành tinh thể đá trong quá trình đông lạnh và rã đông, đặc biệt khi tính đến tốc độ làm lạnh và rã đông của các môi trường khác nhau.

Yếu tố quan trọng nhất sau khi trữ lạnh và rã đông noãn là sức sống cũng như khả năng thụ tinh và phát triển của noãn. Ngoài sự hình thành tinh thể đá trong quá trình trữ và rã, các vấn đề về dụng cụ trữ, nồng độ và loại CPA, nhiệt độ cũng như thời gian tiếp xúc với CPA cũng có thể ảnh hưởng đến khả năng phát triển của noãn về sau nhưng chưa được nghiên cứu nhiều do các vấn đề về đạo đức và pháp lý. Một đặc điểm nữa đó là sự thay đổi về thể tích tế bào, trong phương pháp DP thể tích tế bào co lại đáng kể so với nhóm EP do tế bào không có thời gian trao đổi cân bằng để phục hồi thể tích. Khi tế bào bị co nhỏ lại có thể ảnh hưởng đến khung xương tế bào, đặc biệt là thoi vô sắc – những yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của phôi sau này. Mặc dù vậy, vẫn chưa có một ngưỡng xác định cho sự thay đổi về thể tích của noãn có thể ảnh hưởng đến khả năng phát triển về sau này. Như trong nghiên cứu của Oda và cs, noãn chuột sau khi thụ tinh có thể bị co lại còn 30% thể tích mà vẫn có thể duy trì được khả năng phát triển về sau và kết luận sự co lại không phải là yếu tố ảnh hưởng đến sức sống của noãn. Ngoài ra có thể kết hợp những chiến lược khác để hạn chế stress cơ học trong quá trình thay đổi về thể tích noãn. Do đó, cần thêm các nghiên cứu sơ bộ trên các mô hình động vật để đánh giá tính khả thi của phương pháp mới được đề xuất lên noãn và phôi người.

Việc phân tích qua phản ứng với môi trường trữ rã in silico và in vitro còn tồn tại những hạn chế như các dữ liệu về quá trình co lại và nở ra chỉ là những hình ảnh tĩnh và những giả định được đặt ra để mô phỏng do đó những thông số thẩm thấu đưa ra có thể không phản ánh đúng quá trình sinh học xảy ra trong thực tế. Tuy nhiên, nghiên cứu cũng cho thấy tính khả thi của việc rút ngắn thời gian tiếp xúc với CPA để có thể trữ lạnh noãn và hợp tử an toàn thông qua các kết quả về thể tích của noãn cũng như nồng độ các chất tan trong noãn sau 2 phút trong môi trường nVS và VS. Những kết quả này có thể tạo tiền đề cho các quy trình trữ phôi tốt hơn áp dụng cho giao tử và phôi.

Nguồn: Gallardo, M., Saenz, J., & Risco, R. (2019). Human oocytes and zygotes are ready for ultra-fast vitrification after 2 minutes of exposure to standard CPA solutions. Scientific reports, 9(1), 15986.

Từ khóa: Noãn và hợp tử người có thể được thủy tinh hóa chỉ sau 2 phút trong môi trường trữ với các CPA tiêu chuẩn