CVPH. Lê Thị Quỳnh – IVFMD SIH – Bệnh viện Phụ sản Quốc tế Sài Gòn
 
TỔNG QUAN
Hoạt hóa noãn gồm một loạt các bước cơ bản trong tiến trình thụ tinh xảy ra trước tạo phôi, được đặc trưng bởi việc giải phóng canxi nội bào (Ca²⁺). Ở động vật có vú như chuột và người, hoạt hóa noãn biểu hiện dưới dạng một chuỗi sóng, gọi là dao động Ca²⁺, xảy ra để đáp ứng với phospholipase C zeta đặc hiệu của tinh trùng (PLCζ). PLCζ thủy phân phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) nội bào thành inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3), khởi đầu giải phóng Ca²⁺ từ mạng lưới nội chất thông qua thụ thể IP3. PLCζ hiện diện trong các phân đoạn tinh trùng có khả năng tạo ra dao động Ca²⁺, và sự suy giảm PLCζ làm suy yếu khả năng giải phóng Ca²⁺ trong noãn.
 
Sự thiếu hụt PLCζ có liên quan chặt chẽ với các trường hợp vô sinh ở nam giới khi khiếm khuyết hoạt hóa noãn. Tinh trùng từ những bệnh nhân (BN) này hoặc không thể giải phóng Ca²⁺ trong noãn, hoặc lượng Ca²⁺ giải phóng không đủ ngay cả sau khi ICSI. Việc giải phóng Ca²⁺ do tác động của yếu tố PLCζ có thể là nền tảng cho hiệu quả của quá trình tạo phôi. Tần số và biên độ dao động của Ca²⁺ làm thay đổi cấu trúc protein ở phôi sớm, sự nén phôi và hình thành phôi nang, cũng như tỷ lệ chuyển phôi thành công ở mô hình động vật.
 
Mặc dù việc thiếu PLCζ có liên quan chặt chẽ đến tình trạng vô sinh ở nam giới khi thiếu sự hoạt hóa noãn, nhưng vẫn chưa rõ liệu mức độ PLCζ và sự định vị của PLCζ tinh trùng có phải là cơ sở cho các trường hợp tạo phôi khiếm khuyết và mang thai thất bại sau khi điều trị sinh sản hay không.
 
Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu đánh giá một cách có hệ thống mức độ và mô hình định vị PLCζ trong tinh trùng từ các cặp vợ chồng đang điều trị vô sinh. Mục tiêu của nhóm nghiên cứu nhằm xác định xem liệu PLCζ có tương quan với tốc độ phân chia tế bào, các thông số về chất lượng phôi (phân mảnh, KIDScore, v.v.) và tỷ lệ thai hay không. Đồng thời, sử dụng CRISPR/Cas9 tạo ra chuột đột biến PLCζ nhằm thực hiện các phân tích tương tự, sử dụng tinh trùng đột biến ở con cái kiểu hoang dại (wild type – WT) để tạo phôi trong môi trường được kiểm soát chặt chẽ hơn do những khó khăn liên quan đến trường hợp ở người về độ biến thiên và kích thước mẫu.
 
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Mẫu BN và dữ liệu nghiên cứu được lấy từ labo IVF tại Trung tâm Nghiên cứu và Bệnh viện King Faisal, Vương quốc Ả rập Saudi. Tổng cộng có 54 cặp vợ chồng đã được lựa chọn và phân tích. Tiêu chí nhận đối với nam: mật độ tinh trùng tối thiểu 5×10⁶ tinh trùng/ml, đối với nữ: ít nhất 5 noãn trong mỗi chu kỳ điều trị. Phân tích PLCζ tinh trùng được thực hiện trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu. Hệ thống CRISPR/Cas9 được sử dụng đồng thời để tạo ra các đột biến indel và đột biến nucleotide đơn trong gen PLCζ để tạo ra các chủng chuột đột biến PLCζ. Tinh trùng PLCζ được đánh giá bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang và phương pháp xác định miễn dịch với một kháng thể có tính đặc hiệu nhất quán được xác nhận chống lại PLCζ.
 
KẾT QUẢ
Có mối tương quan thuận có ý nghĩa thống kê giữa độ huỳnh quang tương đối của PLCζ và mật độ tương đối PLCζ với thời gian CC2 (second cell division) (r =0,26 và r = 0,43 tương ứng) và S2 (third cell division) (r =0,26).
 
Việc kiểm tra các kiểu định vị cũng chỉ ra mối tương quan đáng kể giữa sự hiện diện hay vắng mặt của PLCζ và CC2 (r =0,27 và r =−0,27 tương ứng; P ≤ 0,025). Nồng độ PLCζ người đạt mức cao nhất trong thời gian lý tưởng CC2 từ 8–12 giờ và thấp hơn khi nằm ngoài khoảng lý tưởng (<8 giờ và >12 giờ).
 
Tỷ lệ thai thành công cao hơn đáng kể (P ≤ 0,05) ở các giá trị PLCζ lớn hơn ngưỡng ở cả huỳnh quang tương đối (lần lượt là 19% so với 40%) và mật độ tương đối (8% so với 54%). Phân tích miễn dịch huỳnh quang đã được báo cáo trước đó (Kashir và cs., 2021) trong tinh trùng WT, trong khi tinh trùng từ chuột đột biến PLCζ biểu hiện kiểu huỳnh quang giảm dần và phân tán đáng kể ở vùng thể cực đầu của tinh trùng. Các thí nghiệm nhân giống cho thấy kích thước (số) lứa chuột đực PLCζ đột biến giảm đáng kể so với chuột WT, trong khi phôi được tạo ra bằng IVF sử dụng tinh trùng từ chuột PLCζ đột biến cho thấy tỷ lệ đa thụ tinh cao và số lượng phôi phát triển giảm đáng kể.
 
THẢO LUẬN
Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng nhiều yếu tố của người cha có thể ảnh hưởng đến quá trình tạo phôi. Yếu tố nam khác nhau bao gồm trung thể, các bản sao phiên mã RNA và protein khác nhau và tính toàn vẹn của DNA có thể ảnh hưởng đến quá trình thụ tinh cũng như giai đoạn đầu phát triển của phôi. Khả năng tạo phôi kém trước đây được cho là do các thông số tinh trùng kém, trong khi gần đây đã có nghiên cứu chứng minh mối liên hệ chặt chẽ giữa cấu hình PLCζ và các thông số tinh trùng ở BN.
 
Dữ liệu của nghiên cứu chỉ ra rằng trong tinh trùng từ các trường hợp phôi biểu hiện CC2 trong vòng 8–12 giờ có mức PLCζ cao hơn và tỉ lệ mang thai cao hơn đáng kể so với các mốc thời gian khác.
 
Tương tự đối với các thí nghiệm trên chuột đột biến, các thí nghiệm nhân giống sử dụng con đực đột biến PLCζ với con cái WT cho thấy kích thước lứa đẻ giảm nghiêm trọng. Điều này tương quan với việc giảm PLCζ trong tinh trùng của chuột, cho thấy hiệu quả sinh con sống giảm đi cùng với việc bất thường PLCζ. Điều này tương ứng với việc giảm tỷ lệ phôi được tạo ra. Thử nghiệm trên mô hình động vật mang lại kết quả tương tự như ở người. Theo đó, việc giảm PLCζ vẫn thụ tinh thành công, nhưng làm giảm hiệu quả tạo phôi và giảm nghiêm trọng khả năng mang thai.
 
Kết quả của cả thí nghiệm trên người và chuột đều ủng hộ khẳng định PLCζ có thể ảnh hưởng đến chất lượng của quá trình tạo phôi ngoài quá trình thụ tinh.
 
Mặc dù kết quả thu được giữa 2 thí nghiệm tương đương, nhưng về bản chất, dữ liệu về chuột và người trong nghiên cứu là các phân tích độc lập. Sự thay đổi về mức độ protein PLCζ nhóm nghiên cứu quan sát thấy ở tinh trùng chuột có thể là do các đột biến được đưa vào theo phương pháp CRISPR/Cas9. Tuy nhiên, sự biến đổi về mức độ protein PLCζ trong tinh trùng của con người vẫn chưa được tính đến.
 
KẾT LUẬN
Nhóm nghiên cứu thấy rằng cần có mức PLCζ tối thiểu trong một phạm vi cụ thể để sự phát triển phôi sớm tối ưu, tương quan với việc tăng tỉ lệ thai. Mức PLCζ dưới ngưỡng có liên quan đến quá trình tạo phôi không hiệu quả và tỷ lệ thai thấp hơn, mặc dù có diễn ra sự thụ tinh thành công ở cả chuột và người. Đây là nghiên cứu đầu tiên về mức độ PLCζ tinh trùng giúp tiên lượng về hiệu quả tạo phôi và tỷ lệ thai ở người. Dữ liệu của nghiên cứu gợi ý rằng việc sử dụng PLCζ trên lâm sàng có thể không chỉ mang lại lợi ích cho một nhóm đối tượng vô sinh nam (PLCζ hoàn toàn bị khiếm khuyết), mà còn mang lại lợi ích cho số lượng lớn hơn các cặp vợ chồng đang tìm kiếm điều trị vô sinh.
 
Tài liệu tham khảo: Kashir, J et al (2024). The mammalian sperm factor phospholipase C zeta is critical for early embryo division and pregnancy in humans and mice. Human reproduction (Oxford, England), deae078. Advance online publication. https://doi.org/10.1093/humrep/deae078.

Từ khóa: phospholipase C zeta (PLCzeta), kích hoạt tế bào trứng, vô sinh, động học hình thái, thụ tinh, CRISPR, canxi, thiếu hụt kích hoạt tế bào trứng (OAD), mô hình động vật.