CNSH.Đỗ Lê Đình Thiện - IVFMD Phú Nhuận

Giới Thiệu
Suy giảm dự trữ buồng trứng (Diminished ovarian reserve – DOR) đặc trưng bởi sự giảm số lượng và chất lượng noãn, thường được chẩn đoán dựa trên các tiêu chí sau: tăng nồng độ hormone kích thích nang noãn (follicle-stimulating hormone – FSH) (> 10 mIU/ml), số lượng nang noãn thứ cấp đầu chu kỳ (antral follicle count – AFC) (< 5 đến 7) hoặc nồng độ AMH (anti-Mullerian hormone) giảm (< 0,5 đến 1,1 ng/mL). Mặc dù nhiều bằng chứng hiện tại cho thấy DOR có thể bị ảnh hưởng bởi di truyền, khả năng miễn dịch, yếu tố môi trường và các yếu tố gây bệnh, nhưng các yếu tố này vẫn chưa được xác định rõ ràng. Các biện pháp can thiệp dược lý thực sự hiệu quả cho DOR hiện đang còn thiếu, dẫn đến những thách thức đáng kể về thể chất và tinh thần cho những phụ nữ bị mắc phải. Ngay cả khi phụ nữ mắc DOR có sự hỗ trợ của công nghệ hỗ trợ sinh sản (assisted reproduction technology – ART), cơ hội mang thai của họ vẫn bị ảnh hưởng do số lượng noãn hạn chế và dưới mức tối ưu.
 
Tế bào hạt (granulosa cell – GC) buồng trứng có vai trò quan trọng trong việc nuôi dưỡng noãn bằng cách cung cấp các chất dinh dưỡng thiết yếu và tham gia vào các quá trình như trưởng thành noãn, rụng trứng và thụ tinh thông qua con đường truyền tín hiệu cận tiết, từ đó ảnh hưởng đến chất lượng noãn. MicroRNA (miRNA), một loại RNA không mã hóa, điều hòa biểu hiện gen bằng cách tương tác với vùng 3′-UTR của mRNA mục tiêu. Trong in vivo, các pre-miRNAs được xử lý bởi Dicer để tạo ra các miRNAs trưởng thành (mature miRNAs). Việc loại bỏ có điều kiện gen Dicer1 trong GC buồng trứng ở chuột được cho là có liên quan đến sự bất thường trong trưởng thành noãn, rối loạn rụng trứng và vô sinh. Thêm vào đó, ngày càng nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng quá trình apoptosis hoặc tăng sinh GC buồng trứng có thể được điều chỉnh bằng cách tăng hoặc giảm biểu hiện của miRNA chẳng hạn như miR-92a, miR484, miR-181.
 
Ở các nghiên cứu trước đây cho thấy có sự khác biệt đáng kể trong biểu hiện của 70 miRNA trong tế bào hạt dịch nang của phụ nữ DOR lớn tuổi so với phụ nữ có dự trữ buồng trứng bình thường (normal ovarian reserve – NOR) còn trẻ ở việc tăng đáng kể biểu hiện miR-6881-3p. Tuy nhiên, vai trò của miR-6881-3p trong cơ chế bệnh sinh phân tử ở khả năng sinh sản của phụ nữ vẫn chưa được tìm hiểu. Nghiên cứu này nhằm mục đích làm sáng tỏ sự liên quan của miR-6881-3p trong việc điều chỉnh chức năng của tế bào hạt (GC) và cơ chế bệnh sinh của DOR.
 
Phương pháp:
Từ tháng 1 đến tháng 5 năm 2019 có 30 bệnh nhân tiến hành chọc hút noãn để thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) hoặc tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI) tại Trung tâm Sinh sản và Di truyền, Bệnh viện trực thuộc Đại học Y học cổ truyền Sơn Đông Trung Quốc. Hai mươi người tham gia được chẩn đoán mắc DOR theo tiêu chí Bologna (AFC<5–7 hoặc AMH< 0,5–1,1 ng/mL), trong khi 10 bệnh nhân còn lại trải qua ICSI do yếu tố nam và đóng vai trò đối chứng.
Tiêu chuẩn nhận:

• Độ tuổi từ 20 đến 45 tuổi
• Không thể thụ thai tự nhiên trong ít nhất 1 năm

Tiêu chuẩn loại:

• Bệnh nhân bị lạc nội mạc tử cung
• Tăng prolactin máu
• Bệnh tự miễn hoặc bất kỳ tình trạng nào khác có thể ảnh hưởng đến chất lượng noãn
• Rối loạn huyết học
• Có khối u buồng trứng, hoặc khối u ác tính khác
• Tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh
• Hội chứng Cushing

 
Tất cả bệnh nhân được kích thích buồng trứng bằng phác đồ antagonist. GCs sau khi thu nhận từ dịch nang được bảo quản trong tủ đông -80⁰C để phân tích.
 
Việc điều khiển biểu hiện miR-6881-3p đạt được thông qua việc thay đổi các tế bào KGN bằng cách biến nạp gen mô phỏng miR-6881-3p, gen ức chế và kiểm soát âm miRNA (NC). Cuối cùng, nhóm nghiên cứu đã kiểm tra mối tương quan giữa mức độ biểu hiện gen mục tiêu của GC từ bệnh nhân NOR và DOR và mối liên hệ của chúng với kết quả ART.
 
Kết quả:

• Nhóm nghiên cứu đã thu thập mẫu dịch nang từ 30 bệnh nhân, bao gồm 10 mẫu từ bệnh nhân NOR và 20 mẫu từ bệnh nhân DOR. Trong nhóm DOR, số lượng AFC (5 [4,25-6] so với 24 [18,25-24], p<0,001) và mức AMH (0,32 [0,21-0,74] so với 4,58 [3,48-6,95], p<0,001) thấp hơn đáng kể so với nhóm NOR. Mức FSH cơ bản (15,75 [13,00-19,54] so với 6,08 [5,36-7,56], p<0,001) trong nhóm DOR cao hơn đáng kể so với nhóm NOR. Không có sự khác biệt đáng kể về tuổi tác, thời gian vô sinh, chỉ số BMI, estradiol cơ bản hoặc progesterone cơ bản (p>0,05).

Mức độ biểu hiện miR-6881-3p

• Mức độ biểu hiện miR-6881-3p trong nhóm DOR cao hơn đáng kể so với nhóm NOR (p<0,01). Phân tích sâu hơn đã chứng minh mối tương quan giữa mức độ biểu hiện miR-6881-3p trong GC có nguồn gốc từ dịch nang của người và FSH cơ bản (r = 0,522, p= 0,003).
• Mức độ biểu hiện miR-6881-3p tương quan nghịch với AMH (r=-0,492, p=0,006), AFC (r =-0,462, p = 0,010), estradiol vào ngày trigger (r=-0,53, p=0,003), số lượng noãn thu được (r=-0,566, p=0,001), số lượng noãn đã thụ tinh (r=-0,53, p=0,003), số lượng noãn được thụ tinh bình thường (r=-0,551, p=0,002) và số lượng phôi (r=-0,544, p=0,002).
• Không có sự liên quan đáng kể nào được quan sát giữa mức độ biểu hiện miR-6881-3p và tuổi, LH cơ bản, estradiol cơ bản, progesterone cơ bản, LH hoặc progesterone vào ngày trigger hoặc số lượng phôi tốt (p​​>0,05 tất cả).

Gen SMAD4 là mục tiêu trực tiếp của miR-6881-3p

• Đánh giá tác động của miR-6881-3p đến sự biểu hiện của SMAD4 và TGFBR1 trong các tế bào KGN. Chất mô phỏng/chất ức chế miR-6881-3p tổng hợp được biến nạp vào tế bào KGN. Kết quả cho thấy rằng SMAD4 đã được điều hòa quá mức trong nhóm biến nạp chất mô phỏng miR-6881-3p và được điều chỉnh lại trong nhóm biến nạp chất ức chế miR-6881-3p. Tuy nhiên, sự biểu hiện tương đối của TGFBR1 mRNA đã được điều chỉnh tăng trong cả nhóm biến nạp chất ức chế và mô phỏng miR-6881-3p (p<0,01). Điều này xác nhận rằng miR-6881-3p có thể liên kết trực tiếp với SMAD4 mRNA trong tế bào KGN và điều hòa âm quá trình phiên mã của nó.
• Nghiên cứu ảnh hưởng của miR-6881-3p đến chức năng GC thông qua phương pháp đếm dòng chảy tế bào (Flow cytometry) cho thấy mô phỏng miR-6881-3p làm giảm đáng kể tỷ lệ tế bào sống sót và tăng tỷ lệ tế bào apoptotic sớm và muộn (p<0,05). Xu hướng ngược lại được quan sát thấy ở nhóm ức chế miR-6881-3p (p<0,01). Tuy nhiên, không có sự khác biệt đáng kể nào trong quá trình phát triển của chu kỳ tế bào được quan sát thấy trong nhóm chuyển đổi chất ức chế miR-6881-3p của tế bào KGN (p>0,05). Những kết quả này cho thấy miR-6881-3p thúc đẩy quá trình tự chết tế bào KGN.

Tăng biểu hiện apoptotic GC trong dịch nang

• Phân tích sâu hơn về các mẫu GC dịch nang (n = 30) cho thấy mức độ biểu hiện của SMAD4 mRNA và protein trong nhóm DOR thấp hơn đáng kể so với các mẫu trong nhóm NOR (p<0,01). Mức độ biểu hiện SMAD4 mRNA trong GC từ dịch nang ở người cho thấy mối tương quan nghịch đáng kể với mức độ biểu hiện miR-6881-3p (r=-0,570, p=0,001). Một mối tương quan nghịch đáng kể đã được quan sát giữa nồng độ SMAD4 mRNA trong GC từ dịch nang ở người và FSH cơ bản (r =-0,567, p=0,001) hoặc LH vào ngày kích hoạt (r=-0,450, p=0,013), nhưng có mối tương quan thuận với AMH (r=0,526, p=0,003), AFC (r=0,607, p<0,001), estradiol vào ngày kích hoạt (r=0,582, p=0,001), số lượng noãn thu được (r=0,627, p<0,001), số lượng noãn được thụ tinh (r=0,681, p<0,001), số lượng noãn được thụ tinh bình thường (r=0,621, p<0,001) và số lượng phôi (r =0,585, p<0,001). Không mối liên hệ giữa mức độ mRNA SMAD4 và tuổi, LH cơ bản, estradiol cơ bản, progesterone cơ bản, progesterone vào ngày kích hoạt hoặc số lượng phôi tốt (tất cả p>0,05).
• Mức độ biểu hiện của thụ thể FSH (FSHR), thụ thể hormone luteinizing/choriogonadotropin (LHCGR) và enzyme phân cắt chuỗi bên cholesterol (CYP11A1) được điều hòa giảm trong nhóm biến nạp chất mô phỏng miR-6881-3p và được điều hòa tăng trong nhóm biến nạp chất ức chế miR-6881-3p (p<0,01). Tuy nhiên, sự biểu hiện của LHCGR mRNA đã được điều hòa tăng trong nhóm biến nạp chất mô phỏng miR-6881-3p và được điều hòa giảm trong nhóm biến nạp chất ức chế miR-6881-3p (p<0,01). Các kết quả trên chỉ ra rằng tác dụng của miR-6881-3p đối với tế bào hạt không chỉ giới hạn ở quá trình apotosis tế bào mà còn có thể ảnh hưởng hơn nữa đến sự biểu hiện khác nhau của thụ thể gonadotropin và quá trình điều hòa sinh tổng hợp hormone steroid.

Kết luận:
Nghiên cứu này nhấn mạnh vai trò của miR-6881-3p trong việc tác động trực tiếp vào SMAD4 mRNA, sau đó làm giảm khả năng sống của tế bào hạt và thúc đẩy quá trình apoptosis, đồng thời có thể ảnh hưởng đến việc điều hòa hormone steroid và tiếp nhận tín hiệu gonadotropin trong tế bào hạt. Những phát hiện này góp phần vào sự hiểu biết của chúng ta về cơ chế bệnh sinh của DOR. Tuy nhiên, cần có thêm các thử nghiệm in vivo nghiêm ngặt hơn để xác định những phát hiện của nghiên cứu.

Nguồn: Ju, W., Zhao, S., Wu, H. et al. miR-6881-3p contributes to diminished ovarian reserve by regulating granulosa cell apoptosis by targeting SMAD4. Reprod Biol Endocrinol 22, 17 (2024). https://doi.org/10.1186/s12958-024-01189-8
 

Từ khóa: ART, apoptosis, DOR, miR-6881-3p, SMAD4, giảm dự trữ buồng trứng, tế bào hạt