CNSH. Trần Nhật Ánh Dương – IVFMD Tân Bình

Khả năng sinh sản của người phụ nữ tỉ lệ nghịch với độ tuổi. Song song với việc giảm số lượng nang noãn là sự suy giảm chất lượng noãn và tăng thể dị bội, suy giảm chức năng buồng trứng, và cuối cùng có thể dẫn đến vô sinh, đặc biệt là ở phụ nữ trên 38 tuổi. Một trong những nguyên nhân chính gây nên sự già hóa noãn là do sự gia tăng các gốc tự do (reactive oxygen species- ROS) và kết quả là làm suy yếu hệ thống phòng thủ chống oxy hóa của cơ thể. Trong quá trình trưởng thành noãn trong ống nghiệm (In vitro maturation-IVM), ROS trong noãn có thể được tạo ra từ nguồn oxy ở môi trường nuôi cấy bên ngoài và sự trao đổi chất bên trong noãn có nguồn gốc từ ty thể. Bất kể có nguồn gốc từ đâu, ROS đều có thể gây tổn thương DNA, rối loạn chức năng tế bào và dẫn tới apoptosis.

Để giảm stress oxy hóa do ROS gây ra, các nhà khoa học đã khám phá việc sử dụng nhiều chất bổ sung chống oxy hóa như resveratrol, hormone tăng trưởng, melatonin, ... Quercetin (3, 3′, 4′, 5, 7-pentahydroxylflavone) là một hợp chất flavonoid tự nhiên được tìm thấy trong các loại thực vật như quả mọng, bông cải xanh, táo và hành. Các nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng quercetin có thể ngăn ngừa rối loạn chức năng ti thể bằng cách loại bỏ các sản phẩm oxy hóa, loại bỏ ROS và kích thích các enzym chống oxy hóa. Hơn nữa, một số nghiên cứu gần đây cũng đã chỉ ra rằng quercetin có thể tăng cường khả năng chống oxy hóa của buồng trứng ở chuột đã mãn kinh, có thể làm chậm quá trình già hóa noãn của chuột và có thể cải thiện đáng kể tỷ lệ IVM ở lợn và dê. Do đó, mục tiêu của nghiên cứu này là đánh giá tính khả thi của việc sử dụng quercetin để cải thiện chất lượng noãn IVM và khả năng kháng ROS ở đối tượng chuột già và phụ nữ lớn tuổi.

THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu trên động vật: Sử dụng mô hình chuột cái Kun Ming (KM), từ 9 đến 10 tháng tuổi (khi khả năng sinh sản giảm nhanh chóng) và chuột cái non 6 đến 8 tuần tuổi được sử dụng làm nhóm đối chứng. Thu nhận noãn từ giai đoạn túi mầm (GV – germ vesicle), nuôi cấy trong môi trường có bổ sung quercetin hoặc không bổ sung quercetin (nhóm đối chứng). Theo dõi và đánh giá tỷ lệ noãn trưởng thành dựa vào việc xác định tỷ lệ noãn ở giai đoạn phá vỡ túi mầm (germinal vesicle breakdown-GVBD) và tốc độ phóng thích thể cực thứ nhất (First polar body-PbI). Sau khi nuôi cấy IVM, thu nhận các noãn trưởng thành (Metaphase II- MII) và cho thụ tinh, hợp tử và phôi được nuôi cấy trong môi trường có hoặc không bổ sung quercetin. Theo dõi và đánh giá tỷ lệ thụ tinh, sự phát triển và hình thái của phôi.

Nghiên cứu trên người: Thu nhận noãn GV/ GVBD bỏ đi từ những chu kỳ điều trị IVF, bệnh nhân ở độ tuổi từ 22 đến 42, được chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm có hoặc không có bổ sung quercetin vào môi trường nuôi cấy. Đếm số lượng noãn MII thu nhận được và cho thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm. Theo dõi sự phát triển phôi và đánh giá tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ hình thành phôi nang.

KẾT QUẢ
Xử lý noãn của chuột cái già bằng quercetin giúp cải thiện sự trưởng thành noãn và sự phát triển phôi sớm.
Thực hiện một thử nghiệm IVM có bổ sung các nồng độ quercetin khác nhau. Kết quả cho thấy việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy 10 μM quercetin cho tỷ lệ noãn GVBD và tốc độ phóng thích PbI vượt qua nhóm đối chứng và vượt trội hơn các nồng độ xử lý khác. Từ đó cho thấy việc nuôi cấy noãn với quercetin có thể thúc đẩy đáng kể tỷ lệ noãn trưởng thành. Một thử nghiệm thứ hai để đánh giá tác động của quercetin đối với sự phát triển của phôi, tiến hành nuôi cấy phôi trong môi trường có bổ sung quercetin hoặc không. Kết quả là không có sự khác biệt về tỷ lệ phôi giai đoạn 2 tế bào giữa hai nhóm. Tuy nhiên, tỷ lệ hình thành phôi nang của nhóm được bổ sung quercetin tăng đáng kể so với nhóm đối chứng. Từ những kết quả trên đã cho thấy được tiềm năng của quercetin trong việc cải thiện tỷ lệ IVM và khả năng phát triển phôi ở chuột già.

Quercetin giúp cải thiện chất lượng noãn ở chuột già
Theo các nghiên cứu trước đây, suy giảm chất lượng noãn (bao gồm tế bào chất và nhân) là một trong những yếu tố chính gây vô sinh ở phụ nữ lớn tuổi. Thoi vô sắc bất thường và thể dị bội làm giảm cơ hội thụ tinh, tăng nguy cơ sẩy thai và gia tăng nguy cơ dị tật bẩm sinh. Để đánh giá chất lượng noãn, noãn MII thu nhận được nuôi cấy trong môi trường có hoặc không có bổ sung Quercetin sau IVM, tiến hành đánh giá và so sánh hình thái thoi vô sắc và sự sắp xếp nhiễm sắc thể. Kết quả cho thấy, nhiều dạng bất thường nghiêm trọng khác nhau trong nhóm đối chứng, bao gồm các thoi vô sắc dài, không có cực rõ ràng và lệch nhiễm sắc thể. So với nhóm đối chứng, việc điều trị bằng quercetin làm giảm đáng kể tỷ lệ bất thường thoi vô sắc và nhiễm sắc thể.

Quan sát và đánh giá sự phân bố của các hạt vỏ (Cortical granules-CGs) trong các noãn cũng ghi nhận được kết quả tương tự. Các noãn được xử lý bằng quercetin có tỷ lệ phân bố CGs bình thường cao hơn, CGs sắp xếp theo lớp phân bố đều bên dưới màng noãn bào và không phân bố gần thoi vô sắc. Tuy nhiên, hơn 50% số noãn ở nhóm đối chứng cho thấy sự phân bố CGs bất thường, bao gồm gia tăng sự di chuyển về phía thoi vô sắc hoặc phân bố không đồng đều. Từ đó chứng minh được rằng quercetin là một tác nhân mạnh mẽ để chống lại sự suy giảm chất lượng liên quan đến tuổi ở các noãn IVM.

Phân tích toàn bộ bản sao RNA của các noãn được xử lý bằng quercetin từ những con chuột già
Tiến hành giải trình tự RNA của noãn MII được nuôi cấy trong môi trường có hoặc không có bổ sung Quercetin sau IVM. Nhóm nghiên cứu đã nhận thấy Quercetin làm thay đổi biểu hiện gen liên quan đến nhiều quá trình sinh học, thành phần tế bào và chức năng phân tử. Quercetin làm gia tăng sự biểu hiện của nhiều gen điều hoà có chức năng liên quan đến quá trình trao đổi chất chống oxy hoá (Sod2, Gpx4), sự phát triển noãn và phôi (Hmga2, Ube2e3, Bmp15, Gdf9), quá trình tự thực bào (autophagy) (Nbr1), lão hoá (Sirt3) và chuỗi hô hấp ở ty thể (Mtch2), cũng như làm giảm biểu hiện một số gen có liên quan đến quá trình apoptosis (Il6, Caspase9).

Quercetin cải thiện chức năng ti thể trong noãn của chuột già
Sự suy giảm chất lượng noãn có liên quan đến rối loạn chức năng của ty thể, nguyên nhân dẫn đến vô sinh. Tác động của quercetin đối với chức năng của ty thể được đánh giá theo 4 cách: sự phân bố của ty thể, điện thế màng ty thể (mitochondrial membrane potential-MMP), mức ATP và siêu cấu trúc của ty thể. Kết quả cho thấy noãn được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung quercetin cho thấy giảm tỷ lệ bất thường trong sự phân bố ti thể, tăng chỉ số MMP, tăng nồng độ ATP, giảm những bất thường về siêu cấu trúc ty thể so với nhóm đối chứng.

Quercetin làm giảm quá trình apoptosis và cải thiện khả năng tự thực bào của các noãn già hoá
ROS kích hoạt quá trình apoptosis của noãn qua trung gian ti thể ở một số loài động vật có vú. Phân tích TUNEL cho thấy quercetin làm giảm mức độ sản sinh ROS nội bào. Hơn nữa, nhóm nghiên cứu còn cho thấy rằng sự hoạt hóa gen caspase3 (dấu hiệu apoptosis) đã giảm đáng kể trên các noãn được xử lý bằng quercetin so với nhóm không được điều trị.

Tự thực bào là một cơ chế tồn tại của tế bào có thể giúp ngăn chặn quá trình apoptosis bằng cách loại bỏ các bào quan bị hư hỏng trong lysosome. Kết quả của nghiên cứu đã ghi nhận được quercetin có thể giúp ngăn chặn sự suy giảm chất lượng noãn bằng cách tăng LC3, một protein đánh dấu tự thực bào nằm trên màng autophagosome, từ đó giúp giảm quá trình apoptosis và cải thiện khả năng tự thực bào của noãn.

Quercetin làm tăng hoạt tính chống oxy hóa thông qua quá trình khử acetyl hóa SOD2K68 qua trung gian SIRT3
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng SIRT3 có thể khử SOD2K68, giúp kích hoạt SOD2 và do đó có khả năng làm tăng hoạt tính chống oxy hóa của nó. Kết quả nghiên cứu cho thấy việc bổ sung quercetin làm giảm đáng kể mức SOD2K68 trong noãn qua trung gian SIRT3. Hơn nữa, khi tiến hành phân tích mức độ ROS cũng cho thấy rằng các noãn được xử lý với quercetin có mức độ ROS trong tế bào thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng.

Quercetin cải thiện kết quả IVM và sự phát triển phôi sớm ở người
Từ những phát hiện trên, nghiên cứu được mở rộng sang sử dụng noãn người. Nhóm tác giả cũng tiến hành kiểm tra tác động của quercetin trên noãn IVM và sự phát triển phôi ở người. Kết quả ghi nhận được rằng việc bổ sung quercetin giúp gia tăng đáng kể tốc độ phát triển của noãn, cả tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ tạo phôi nang đều cao hơn nhiều so với nhóm đối chứng. Hơn nữa, tỷ lệ phôi nang chất lượng tốt ở nhóm bổ sung quercetin nhiều hơn đáng kể so với nhóm chứng. Từ những kết quả trên đã cho thấy quercetin có khả năng cải thiện sự trưởng thành noãn và sự phát triển phôi sớm trong TTTON ở người.
 
KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã chứng minh rằng quercetin làm giảm stress oxy hóa liên quan đến tuổi và giúp cải thiện chất lượng noãn, thúc đẩy sự trưởng thành của noãn IVM và sự phát triển phôi sớm ở chuột và ở người. Do đó, những phát hiện này đề xuất một chiến lược tiềm năng để ứng dụng quercetin như một biện pháp giúp ngăn chặn hoặc trì hoãn sự suy giảm chất lượng noãn do tuổi tác và cải thiện tỷ lệ thành công của TTTON ở người. 

Nguồn: Yongzhi Cao, Haibin Zhao, Zhao Wang và cộng sự; Quercetin promotes in vitro maturation of oocytes from humans and aged mice; Cell death & disease; 11 November 2020; 1-15.

Từ khóa: Quercetin thúc đẩy quá trình trưởng thành noãn trong ống nghiệm của noãn người và chuột cái già