CN. Phạm Bích Vân - IVF Tâm Anh
 

Nuôi cấy noãn và phôi trong các phòng khám sinh sản và phòng thí nghiệm thường được thực hiện trong đĩa nhựa Petri với các giọt môi trường nuôi cấy được được phủ một lớp dầu để ngăn ngừa sự xâm nhiễm và bay hơi, thường được gọi là hệ thống kín. Việc nuôi cấy dưới lớp dầu giúp dễ dàng di chuyển các đĩa trong phòng thí nghiệm, hỗ trợ thao tác trong thời gian dài ngoài tủ cấy, tạo điều kiện cho các thí nghiệm ngoài cơ thể (ex-vivo). Tuy nhiên, dầu phủ có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của các chất ức chế phân tử nhỏ liên quan đến chu kỳ tế bào, khi thuốc phân tách vào dầu. Nghiên cứu này chỉ ra rằng việc thay đổi tỉ lệ giữa môi trường và dầu ảnh hưởng lớn đến nồng độ hiệu quả của chất ức chế và tác động này có thể ảnh hưởng đáng kể đến việc giải thích dữ liệu đã được công bố, vì vậy nhóm tác giả cũng đề xuất các phương pháp thí nghiệm và dữ liệu mới trong các nghiên cứu tương tự.

Kết quả

Tỉ lệ môi trường/dầu làm thay đổi EC50 của nocodazole trong các thí nghiệm trưởng thành noãn.

Nghiên cứu kiểm tra tác động của tỉ lệ môi trường/dầu lên hiệu quả của nocodazole, một chất ức chế ngăn chặn sự tống xuất thể cực (Polar body extrusion - PBE) bằng cách làm phá vỡ thoi vô sắc và dẫn đến kích hoạt điểm kiểm soát ở thoi vô sắc (The spindle assembly checkpoint  - SAC). Để kiểm tra giả thuyết rằng dầu có làm giảm hiệu quả của các chất ức chế hay không thì nhóm tác giả đã thực hiện thí nghiệm nuôi cấy noãn có tỉ lệ dầu và môi trường khác nhau bao gồm một đĩa không có dầu và các đĩa còn lại có tỉ lệ môi trường/dầu  từ 1:1000 đến 1:10, để xác định sự thay đổi của EC50 (nồng độ cần thiết để ngừng sự xuất hiện thể cực đầu tiên) của nocodazole. Kết quả cho thấy rằng tỉ lệ môi trường/dầu có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả của nocodazole, với EC50 thay đổi hơn 10 lần từ 50,7 nM (trong môi trường không có dầu) lên đến 785 nM trong môi trường có phủ dầu (tỉ lệ môi trường/dầu là 1:1000). Các thiết lập có tỉ lệ môi trường/dầu khác nhau có ảnh hưởng đáng kể đến EC50 của nocodazole, ngay cả khi sử dụng hai loại dầu khác nhau (dầu nặng và dầu nhẹ). 
 

Tỉ lệ môi trường/dầu thay đổi EC50 của nocodazole trong quá trình phát triển phôi.
Để xác định liệu hiện tượng tương tự có thể quan sát được ở các phôi tiền làm tổ hay không, nhóm tác giả đã thu thập phôi 2 tế bào và nuôi cấy chúng trong điều kiện có nocodazole, với các thiết lập đĩa nuôi cấy tương tự như trong nghiên cứu với noãn. Kết quả cho thấy khi môi trường không có phủ dầu, với 100 nM nocodazole hoàn toàn ức chế sự phát triển phôi đến giai đoạn 4 tế bào. Tuy nhiên một số tế bào vẫn có thể phân chia khi nuôi cấy trong giọt môi trường 20 µL có phủ dầu (tỉ lệ môi trường/dầu 1:100), và chỉ 6% tế bào bị dừng lại ở pha M trong các giọt môi trường 2 µL có phủ dầu (tỉ lệ môi trường/dầu 1:1000). Kết quả này cho thấy rằng giống như ở noãn, nocodazole mất tác dụng dưới dầu và không kích hoạt SAC, hiện tượng này cũng có thể quan sát được trong các thí nghiệm nuôi cấy phôi.

 

Tác động của dầu đối với các chất ức chế chu kỳ tế bào khác nhau

Nhóm nghiên cứu đã phát triển một phương pháp đơn giản để các phòng thí nghiệm có thể kiểm tra tác động của dầu đối với loại thuốc nhất định. Các nhà nghiên cứu đã thử nghiệm năm loại thuốc bổ sung (MG132, kinesin-5 STLC, monastrol, APC APCin, CDK1 roscovitine) với các tỉ lệ môi trường/dầu khác nhau. Phương pháp này bắt đầu bằng việc xác định nồng độ hiệu quả tối thiểu của mỗi thuốc trong môi trường không có dầu, sau đó sử dụng nồng độ đó để nghiên cứu tác động của các tỉ lệ môi trường/dầu khác nhau. Mặc dù phương pháp này không xác định được sự thay đổi chính xác của EC50, nhưng nó cung cấp một chỉ số có thể định lượng được mức độ mất hoạt tính của thuốc dưới tác động của dầu. Kết quả cho thấy dầu làm giảm hiệu quả của hầu hết các thuốc, bao gồm khả năng ức chế PBE bị giảm mạnh đối với MG132, STLC, monastrol và ngăn chặn mạnh mẽ roscovitine trong việc ức chế GVBD. Tuy nhiên, APCin là một ngoại lệ khi chất ức chế này vẫn duy trì khả năng ngăn chặn PBE ngay cả ở tỉ lệ môi trường/dầu thấp. Ngoài ra, nghiên cứu cũng phát hiện rằng thời gian tiếp xúc dài hơn với dầu (24 giờ) làm mất hoạt tính của MG132 mạnh mẽ hơn, điều này chỉ ra rằng ngay cả thời gian chuẩn bị đĩa (ví dụ, liệu các đĩa có được chuẩn bị từ đêm hôm trước hay không) cũng ảnh hưởng đến EC50 của thuốc.. Nghiên cứu này nhấn mạnh vai trò quan trọng của dầu trong việc điều chỉnh hoạt tính của thuốc trong các nghiên cứu chu kỳ tế bào và gợi ý cần phải xem xét cẩn thận sự hiện diện của dầu trong các thiết lập thí nghiệm.

Bàn luận

Nghiên cứu này chỉ ra rằng hiệu quả của một số chất ức chế chu kỳ tế bào phổ biến bị thay đổi đáng kể khi nuôi cấy dưới dầu. Giải thích đơn giản nhất là các thuốc phân tán vào trong dầu, khiến dầu đóng vai trò như một bể chứa. Nghiên cứu cho thấy hầu hết các loại thuốc có khả năng phân tách vào dầu, bất kể loại dầu nào, dựa trên tính chất kỵ nước của chúng. Hơn nữa, giá trị LogP được cung cấp thông tin về khả năng hòa tan của chất ức chế trong nước và dầu dựa trên phân chia nước/octanol, và các giá trị này thường hỗ trợ giả thuyết rằng các thuốc có tính kị nước sẽ phân tách vào dầu. Mặc dù một số thuốc bị mất hoạt tính dưới dầu có thể không ảnh hưởng đến kết luận chung của thí nghiệm, nhưng điều này có thể tác động đến việc giải thích kết quả âm tính hoặc nồng độ thuốc cao bất ngờ để tạo ra hiệu ứng dự kiến. Nghiên cứu cũng cảnh báo rằng sự khác biệt về nồng độ thuốc giữa các nghiên cứu có thể do sự khác nhau trong thiết kế đĩa hoặc thời gian chuẩn bị. Mặc dù nghiên cứu chỉ tập trung vào sáu loại thuốc, nhưng các chất ức chế khác như GSK923295 (ức chế CENPE), Protame (ức chế APCcdh1), và Blebbistatin (ức chế myosin ATPase) cũng bị mất hoạt tính dưới dầu. Đặc biệt, một trường hợp ngoại lệ đó là APCin không phân tách vào dầu ngay cả sau 24 giờ ủ, lý do tại sao điều này xảy ra vẫn chưa rõ nhưng trường hợp của APCin cho thấy rằng có thể một số thuốc vẫn ở lại trong môi trường dưới dầu, nhưng đây là trường hợp ít gặp và không thể dự đoán trước vì vậy cần phải được kiểm tra thực nghiệm cho từng loại thuốc nếu nuôi cấy có phủ dầu. Nghiên cứu nhấn mạnh sự cẩn trọng khi sử dụng các chất ức chế phân tử nhỏ dưới điều kiện nuôi cấy có dầu và khuyến cáo nên tránh sử dụng dầu nếu có thể. Nếu việc sử dụng dầu là không thể tránh khỏi, cần tiến hành thử nghiệm kỹ lưỡng để đảm bảo tỉ lệ môi trường/dầu không ảnh hưởng đáng kể đến kết quả. Việc báo cáo chi tiết các điều kiện thí nghiệm, bao gồm tỉ lệ môi trường/dầu và thời gian chuẩn bị đĩa, là rất quan trọng để đảm bảo tính tái lặp trong nghiên cứu.

 

Nguồn: RÉMILLARD-LABROSSE, Gaudeline, et al. Oocyte and embryo culture under oil profoundly alters effective concentrations of small molecule inhibitors. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 2024, 12: 1337937.