CNSH. Phạm Duy Tùng - IVFMD Tân Bình

Trữ đông phôi là một quy trình quan trọng trong hỗ trợ sinh sản nhằm bảo quản phôi trong một thời gian dài. Các phương pháp trữ đông phôi hiện nay được chia thành 2 nhóm: đông lạnh chậm và thủy tinh hóa. Trong phương pháp đông lạnh chậm, phôi được làm lạnh từ từ đến -70^oC trước khi cho vào nitơ lỏng, phôi ở -70^oC được khử nước gần như hoàn toàn và ở trạng thái cận cân bằng với nồng độ các chất bảo vệ đông lạnh (cryoprotectants - CPA) thẩm thấu cao và lượng nước thấp. Thủy tinh hóa là phương pháp hiện được sử dụng thay thế cho phương pháp đông lạnh chậm do không cần máy làm lạnh theo chương trình và quy trình đơn giản hơn, cũng như với tỷ lệ sống cao hơn do không có sự hình thành tinh thể đá nội bào và ngoại bào. Tuy nhiên, thủy tinh hóa vẫn tồn tại một số nhược điểm như phôi sẽ không đạt được trạng thái khử nước hiệu quả như đông lạnh chậm và phải được trữ lạnh dưới -130^oC (nhiệt độ chuyển sang trạng thái thủy tinh), quá trình rã đông cũng phải được thực hiện nhanh chóng để tránh hình thành tinh thể đá nội bào. Một nhược điểm khác của phương pháp thủy tinh hóa là sử dụng CPA thẩm thấu nồng độ cao có thể gây độc cho tế bào.

Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp thủy tinh hóa thông thường, nhóm phát triển phương pháp thủy tinh hóa cân bằng sử dụng EDFS10/10a, với nồng độ CPA thẩm thấu thấp hơn gồm EG 10% (v/v) và 10% (v/v) dimethyl sulfoxide (DMSO) và một lượng nhỏ CPA không thẩm thấu (0,4M sucrose). Môi trường này có độc tính và độ thẩm thấu tương đối thấp (6,43 moles/kg). Phương pháp thủy tinh hóa cân bằng mới sử dụng EDFS10/10a có những lợi thế hơn so với thủy tinh hóa truyền thống:

• An toàn cho phôi hơn do nồng độ CPA và độ thẩm thấu thấp
• Phôi sau khi trữ lạnh có thể bảo quản ở -80^oC trong một thời gian nếu bình chứa nitơ lỏng hỏng hoặc khi cần sắp xếp lại phôi trong thùng chứa.
• Phôi có thể được vận chuyển trong cự ly ngắn bằng đá khô.

Nghiên cứu được thực hiện trên phôi của dòng chuột ICR, kích thích buồng trứng và sau 48 giờ tiêm hCG chuột được cho giao phối và thu nhận phôi 4 và 8 tế bào trong ống dẫn trứng của chuột sau 53-55 giờ và 67-68 giờ sau khi tiêm hCG. Phôi dâu được thu nhận từ tử cung sau 76-78 giờ tiêm hCG. Để có phôi nang, nhóm nuôi những phôi dâu trong 12-16 giờ và chỉ sử dụng những phôi có khoang nhưng chưa có sự giãn nở của màng zona mới được sử dụng. Trong một số thí nghiệm, khoang phôi sẽ được làm sụp bằng kim trước khi trữ lạnh.

Quá trình trữ lạnh phôi được thực hiện với 2 bước:

• Đầu tiên phôi được chuyển vào dung dịch ED5/5 (5%EG và 5% DMSO (v/v)) ở 25^oC trong 2 phút.
• Phôi được chuyển vào giọt môi trường thủy tinh hóa EDFS10/10a, rửa ba lần và sau đó chuyển vào một cột môi trường chứa 0,25ml EDFS10/10a trong dụng cụ trữ ở 25^oC với lượng môi trường chuyển qua là ít nhất. Sau khi phôi tiếp xúc với môi trường thủy tinh hóa trong 60 giây, dụng cụ trữ sẽ được nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng. Một số mẫu trữ lạnh sẽ được chuyển qua bình Dewar được làm lạnh trước bằng ethanol ở -80^oC trong 4, 7 và 28 ngày.

Phôi được rã đông từ -80^oC sẽ được nhúng vào nước có nhiệt độ 25 ^oC, đối với những phôi được trữ trong nitơ lỏng sẽ được giữ ở nhiệt độ phòng trong 10 giây trước khi ngâm vào nước để vượt qua nhiệt độ chuyển hóa thành thủy tinh của tế bào chất nhằm hạn chế tổn thương cho phôi. Phôi sau khi rã đông sẽ được chuyển vào môi trường nuôi cấy và đánh giá tổn thương thông qua hình thái và khả năng phát triển đến các giai đoạn tiếp theo.

Kết quả cho thấy:
Đối với phôi 4 tế bào, tỷ lệ sống sau rã cao, tỷ lệ phôi bào chết sau rã cao hơn so với nhóm đối chứng nhưng không có ý nghĩa thống kê. Tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn phôi dâu không có sự khác biệt so với nhóm chứng. Tuy nhiên tỷ lệ hình thành phôi nang giảm dần khi thời gian bảo quản ở -80^oC dài ngày.

Đối với phôi 8 tế bào, tỷ lệ sống sau rã và tỷ lệ phát triển đến phôi nang gần tương đương với nhóm chứng.

Đối với phôi dâu, tỷ lệ phôi sống sau rã và phát triển lên phôi nang không khác biệt đáng kể so với nhóm chứng nếu trữ lạnh và rã ra ngay. Tuy nhiên khi thời gian trữ kéo dài, tỷ lệ này giảm dần chứng tỏ có hình thành các tinh thể đá nội bào khi lưu trữ ở -80^oC.

Đối với phôi nang:

• Ở nhóm không làm sụp khoang phôi trước khi trữ lạnh, với tỷ lệ phôi nở lại nếu được rã ra trong ngày thấp hơn rất nhiều so với nhóm chứng và hoàn toàn không nở lại nếu được trữ trong 4 ngày. Do đó nhóm kết luận phôi nang không được khử nước hiệu quả cho quá trình thủy tinh hóa.
• Đối với những phôi đã được làm sụp khoang phôi, tỷ lệ phôi nở lại và thoát màng tăng lên đáng kể thậm chí là sau 4 ngày giữ ở -80^oC. Mặc dù vậy, tỷ kệ này giảm dần khi thời gian lưu trữ phôi ở -80^oC tăng lên.

Kết quả nghiên cứu cho thấy phôi chuột ở các giai đoạn phát triển khác nhau có thể được thủy tinh hóa ở trạng thái cân bằng khi sử dụng EDFS10/10a tương tự như phương pháp đông lạnh chậm. Tỷ lệ sống và tiếp tục phát triển ở những phôi giai đoạn phân chia (2,4,8 tế bào) được trữ lạnh bằng phương pháp này cao và gần như tương đương với nhóm chứng, thậm chí khi được lưu trữ dài ngày ở nhiệt độ -80^oC. Điều này cho thấy quá trình khử nước hiệu quả của phương pháp này đối với phôi phân chia. Tuy nhiên, khả năng phát triển của phôi khi được trữ lạnh bằng phương pháp này giảm dần khi thời gian lưu trữ ở -80^oC tăng lên. Tương tự với các nghiên cứu trước đây trên phôi chuột, do ở nhiệt độ này nước trong tế bào có thể thoát khỏi trạng thái thủy tinh nhưng không thể hình thành tinh thể do lượng nước trong tế bào quá thấp, nhưng điều này đủ để khiến một số hoạt động của màng tế bào và tế bào chất có thể diễn ra và khiến EDFS10/10a chuyển từ trạng thái thủy tinh sang dạng lỏng và gây độc cho phôi khi lưu trữ lâu ở -80^oC.

Phương pháp này không thực sự hiệu quả đối với phôi dâu (gần như không có phôi sống sau rã) và phôi nang (tỷ lệ phôi nở lại và thoát màng rất thấp) có thể do sự thay đổi về tính thấm của màng tế bào trong giai đoạn nén của phôi dâu và quá trình khử nước không hiệu quả đối với phôi nang.

Một điểm đáng chú ý nữa đó là khi phôi nang được làm sụp khoang nhân tạo, tỷ lệ phôi sống sau khi rã tăng lên đáng kể, thậm chí khi được trữ ở -80^oC trong 4 ngày. Chứng tỏ phôi được thủy tinh hóa ở trạng thái khử nước và hàm lượng chất tan nội bào tối ưu. Giả thuyết này cần được làm rõ do tính thấm của màng tế bào ở phôi dâu và phôi nang gần như tương tự nhau, vậy tại sao phôi nang sau khi làm sụp khoang lại có thể đạt trạng thái cân bằng tốt hơn?

Tóm lại, thủy tinh hóa cân bằng mang lại nhiều ưu điểm như môi trường có nồng độ CPA thấp ít gây độc cho phôi, không yêu cầu kỹ thuật khéo léo, quy trình nhanh gọn và không cần thiết bị làm lạnh theo chương trình, hữu dụng trên phôi phân chia (2,4,8 tế bào) và phôi nang đã làm sụp khoang phôi, phôi có thể được vận chuyển bằng đá khô. Phương pháp này có thể được phát triển để sử dụng trên phôi người, vốn nhạy cảm với độc tính của CPA và môi trường có độ nhớt cao.

Nguồn: Qiu J, Matsukawa K, Koshimoto C, Edashige K. Equilibrium vitrification of mouse embryos at various developmental stages using low concentrations of cryoprotectants. J Reprod Dev. 2021;67(2):109-114.

Từ khóa: “Thủy tinh hóa cân bằng” phôi chuột ở các giai đoạn phát triển khác nhau sử dụng chất bảo vệ đông lạnh nồng độ thấp