Lược dịch từ “There is only one thing that is truly important in an IVF laboratory: everything”. Cairo Consensus Guidelines on IVF Culture Conditions. Reprod Biomed Online. 2020 Jan;40(1):33-60.
 doi: 10.1016/j.rbmo.2019.10.003.
 
Quyền tác giả: Nhóm Đồng thuận Cairo 2018
Đồng tác giả: Jacques Cohen, ART Washington, Hoa Kỳ
Dịch: Nguyễn Hoàng Thảo, Nguyễn Thị Hồng Vi, Thị Xanh – Khoa HMVS Bệnh viện Phụ Sản Nhi Bình Dương
 
Môi trường nuôi cấy - đệm và pH
Duy trì ổn định độ pH trong giới hạn nhỏ là rất quan trọng đối với chất lượng giao tử và phôi. Độ pH lý tưởng rất khó xác định và có thể thay đổi dựa trên môi trường và thành phần (môi trường đơn bước so với môi trường chuyển tiếp (7,2 - 7,35)) cũng như nhiệt độ. Mức CO₂ thích hợp cho từng điều kiện nuôi cấy phải được xác định và duy trì chặt chẽ. Việc lựa chọn các bộ đệm HEPES và MOPS dường như an toàn để ổn định pH(e) bên ngoài tủ cấy. Người ta đã chứng minh rằng đối với các đĩa nuôi cấy chứa các giọt môi trường 50µl phủ dầu, quá trình hồi phục khí (hiệu chỉnh lại độ pH) mất thời gian dài hơn khoảng 20 lần so với thất thoát khí, mà giảm rất nhanh ngay cả khi có phủ dầu, khi đó độ pH sẽ cao hơn 7,4 trong vòng chưa đến 2 phút (Blake và cs., 1999; Mortimer và cs., 2015). Do đó, khuyến cáo được đưa ra là chỉ nên để đĩa nuôi cấy tiếp xúc với không khí dưới 2 phút.

Môi trường nuôi cấy - thành phần chung và bổ sung protein
Các phòng lab IVF nên sử dụng các môi trường phù hợp với hướng dẫn của nhà sản xuất và theo quy định của nhà nước.
Môi trường nuôi cấy và vi thao tác nên chứa protein, carbohydrate, hỗn hợp các axit amin với glutamine ở dạng dipeptide và thường có kháng sinh. Việc sử dụng phenol red làm chỉ thị pH là tùy chọn. Vì lý do chất lượng, tính nhất quán và khả năng tái sản xuất, các phòng lab nên sử dụng môi trường nuôi cấy được sản xuất thương mại cho hỗ trợ sinh sản ở người. Cần lưu ý rằng việc bổ sung protein ngoại sinh vào môi trường ngoài các khuyến cáo của nhà sản xuất có thể thay đổi thành phần và hiệu quả của môi trường.

Phần lớn các nhà phôi học thực hành trong nhóm cho rằng các nhà sản xuất nên cung cấp các công thức của môi trường nuôi cấy dựa trên nhu cầu được đồng thuận về thành phần nào nên được thêm vào môi trường cấy và ở nồng độ nào; có những lo ngại rằng các thành phần không được khai báo của môi trường nuôi cấy có thể dẫn đến tác hại khó lường cho các thế hệ tương lai. Một số thành viên nhóm đồng thuận đã từ chối thảo luận này do những xung đột tiềm ẩn và vì những lý do khác.

Hiện tại, không có đủ bằng chứng để ủng hộ việc bổ sung các hợp chất hoạt tính sinh học, chẳng hạn như các yếu tố tăng trưởng hoặc protein phức tạp vào môi trường nuôi cấy giao tử và phôi và cần phải có các nghiên cứu về tính an toàn và hiệu quả trước khi đưa vào thường quy.

Các phòng lab IVF phải có các chính sách và quy trình thao tác chuẩn để xác định việc chấp nhận và sử dụng tất cả các môi trường, vật liệu liên quan, theo thực hành tốt nhất và quy định của quốc gia. Điều này bao gồm lưu giữ hồ sơ dài hạn giấy chứng nhận phân tích, số lô sản phẩm môi trường. Phòng lab nên theo dõi hiệu suất liên tục của các vật liệu này.

Môi trường nuôi cấy - môi trường chuyển tiếp hoặc đơn bước trong nuôi cấy phôi
Một tổng quan Cochrane mới đây của Youssef và cộng sự (2015) kết luận rằng không có sự khác biệt về kết quả giữa hai hệ thống nuôi cấy và kết luận này cũng được ủng hộ bởi các tổng quan khác (Dieamant và cs., 2017; Sfontouris và cs., 2016). Tuy nhiên, Sfontouris và cộng sự (2016) đã kết luận rằng “Mặc dù sử dụng một môi trường duy nhất cho nuôi cấy dài ngày có một số lợi thế thực tế và tỷ lệ hình thành phôi nang dường như cao hơn, nhưng không đủ bằng chứng để khuyến cáo môi trường nuôi cấy chuyển tiếp hay đơn bước là ưu việt hơn trong nuôi cấy phôi đến ngày 5/6. Các nghiên cứu trong tương lai so sánh hai hệ thống môi trường này nên được thiết kế tốt hơn".

Các nghiên cứu về ảnh hưởng trên thể khảm và theo dõi sự phát triển của trẻ sinh ra được đánh giá là có chất lượng thấp. Hơn nữa, hội nghị đồng thuận không tìm thấy bằng chứng về sự khác biệt trên tỷ lệ thai cộng dồn giữa chuyển phôi giai đoạn phân chia so với phôi nang chuyển tươi và chuyển phôi trữ từ những chu kỳ chọc hút được một noãn duy nhất, nhưng chú ý rằng bằng chứng có chất lượng rất thấp.

Môi trường nuôi cấy - sử dụng và quản lý/quy trình trữ/lưu trữ
Môi trường nuôi cấy phải:
• Được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 2-8°C
• Tránh ánh sáng (đặc biệt là ánh sáng mặt trời trực tiếp)
• Không sử dụng khi hết hạn
• Dán nhãn thời hạn sử dụng và điều kiện lưu trữ; thông tin này cũng nên có trên tất cả các sản phẩm
• Được sử dụng theo tuần tự số lô/lô

Ánh sáng: Để bảo vệ giao tử và phôi khỏi tiếp xúc với các bước sóng ánh sáng có khả năng gây hại, hãy sử dụng các bộ lọc trong kính hiển vi ngăn chặn được tia cực tím. Tác động của ánh sáng xung quanh thường thấp, đa phần tác động liên quan đến ánh sáng kính hiển vi và điều này cần được cân nhắc đến khi lập kế hoạch cho một phòng lab mới.

Nhiệt độ và vận chuyển:
• Bất kỳ môi trường nuôi cấy nào đã bị đóng băng phải bỏ đi
• Dầu nuôi cấy sẽ không đóng băng nhưng dầu có thể bị lợn cợn, thường phản ánh độ hòa tan của nước hoặc các phân tử khác ở nhiệt độ thấp; điều này không còn khi ở nhiệt độ môi trường. Nếu vậy, dầu không cần phải bỏ.

Nhiệt độ cao có thể dẫn đến:
• Biến chất qua quá trình oxy hóa (liên quan đến mất các hoạt chất)
• Các axit amin và protein có thể trải qua quá trình khử amin (các ion amonium; nguồn chính của amonia là các mono-peptide không ổn định từ glutamine và protein)

Lưu trữ lạnh môi trường nuôi cấy:
Đồng thuận cho rằng các phòng lab IVF nên sử dụng tủ chứa chuyên dụng trong y tế với các kệ lưới để lưu thông, không có thùng kín và không có kệ cửa. Việc sử dụng kết hợp các tủ lạnh/tủ đông không có kiểm soát từng ngăn không được khuyến khích. Hiệu quả của tủ lạnh, về mặt duy trì nhiệt độ ổn định, phụ thuộc vào lượng chứa, nên nằm trong khoảng 30 - 80% khả năng lưu trữ của nó.

Giám sát độc lập và ghi nhật ký nhiệt độ tủ lạnh rất quan trọng. Nên sử dụng nhiệt kế được chứng nhận, hiệu chuẩn, với giám sát từ xa và báo động tự động.

Giám sát và chứng nhận trang thiết bị
Ít nhất cần có sự giám sát liên tục, độc lập các thông số quan trọng của cơ sở hạ tầng và thiết bị phòng lab. Điều này là bắt buộc đối với một số cơ quan được cấp phép/công nhận.

Chứng nhận về chất lượng lắp đặt (thiết bị thể hiện các thông số kỹ thuật bình thường theo nhà sản xuất hoặc đại lý của họ, tại thời điểm lắp đặt), chất lượng hoạt động (việc xác minh các thông số kỹ thuật theo yêu cầu của người dùng và hiệu suất thiết bị được thực hiện bởi người dùng sau khi cài đặt và trước khi sử dụng lần đầu) và chất lượng vận hành (lặp lại định kỳ, bao gồm cả sau khi bảo trì hoặc sửa chữa). Trong những trường hợp này, mục đích là để xác định rằng hiệu suất của thiết bị trong phạm vi dung sai được chấp nhận trong khoảng thông số kỹ thuật của nó (ISO 15189: 2012; Mortimer và cs., 2015).

Giám sát và chứng nhận môi trường nuôi cấy
Có nhiều loại KPI khác nhau nhằm theo dõi các khía cạnh khác nhau của hiệu suất phòng lab, theo đồng thuận Vienna (ESHRE và nhóm Alpha trong Y học sinh sản, 2017).

Thiết bị đo-hiệu chuẩn và chứng nhận
Thiết bị đo đạc cho phòng lab và/hoặc môi trường nuôi cấy phải được chứng nhận và hiệu chuẩn theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Trong trường hợp không có khuyến cáo, việc hiệu chuẩn nên được tiến hành ít nhất hai lần mỗi năm hoặc thường xuyên hơn nếu được yêu cầu để đảm bảo mục đích duy trì liên tục.

Các phép đo pH chính xác có thể khó đạt được do hiệu chuẩn với các bộ đệm không được thiết kế để sử dụng ở 37°C và do đó nên được diễn giải một cách thận trọng. Đo một điểm của máy phân tích khí máu có chức năng tự điều chỉnh có thể cung cấp các phép đo chính xác hơn. Cần lưu ý rằng các máy phân tích khí máu không đo được độ pH của môi trường đệm zwitterion một cách đáng tin cậy.

Chuẩn bị tinh trùng cho IVF
Tinh trùng cho ART phải được tách ra khỏi môi trường tinh dịch không chỉ càng sớm càng tốt sau khi xuất tinh (khi hóa lỏng) mà còn phải hiệu quả nhất có thể (Mortimer, 2000; Bjorndahl và cs., 2010). Tiếp xúc với tinh dịch trong hơn 30 phút sau khi xuất tinh làm giảm vĩnh viễn khả năng thụ tinh của tinh trùng người trong ống nghiệm (Rogers và cs., 1983) và tinh trùng đã chuẩn bị bị nhiễm chỉ với một lượng huyết tương tinh dịch rất nhỏ dạng vết (0,01% v/v = 1/10000) có thể làm giảm khả năng thụ tinh (Kanwar và cs., 1979).

Đối với các tinh trùng IVF đã chuẩn bị, cần phải cân bằng giữa việc đạt được điện dung trong ống nghiệm và tránh mất acrosome sớm và thoái hóa tinh trùng có thể xảy ra ở những người đàn ông có phản ứng cực đầu nhanh, khi tinh trùng của họ được ủ thời gian dài trong điều kiện xảy ra phản ứng cực đầu. Vì vậy, nếu có sự trì hoãn lâu trước khi thụ tinh IVF (ví dụ hơn 2,5 giờ) thì tinh trùng sau lọc rửa phải được cân bằng lại trong môi trường có bổ sung (ví dụ, đệm HEPES) và giữ ở nhiệt độ phòng đến khoảng 2,5 giờ trước khi thụ tinh; sau đó rửa sạch và cấy trong môi trường thụ tinh trong tủ CO₂ 120 phút cuối cùng trước khi cho thụ tinh với noãn.

Tinh trùng đang chuẩn bị cho ICSI có thể sử dụng đệm tinh trùng để cân bằng vì trong ICSI phản ứng cực đầu không liên quan đến thụ tinh. Tinh trùng đã chuẩn bị phải được giữ ở nhiệt độ môi trường để giảm thiểu việc tạo ra ROS (ví dụ: trong hộp xốp để tránh ánh sáng và luồng khí lạnh) cho đến khi đĩa ICSI được chuẩn bị xong.

Từ khóa: Đồng thuận Cairo về điều kiện nuôi cấy trong IVF “Chỉ có một điều thực sự quan trọng trong một phòng lab thụ tinh ống nghiệm, đó là: tất cả mọi thứ” (phần II)