CNSH. Chu Khánh Linh – IVFMDVH

1. Giới thiệu

Nước là thành phần quan trọng cho sự sống. Nó cung cấp dung môi hỗ trợ các hoạt động sinh hóa bên trong tế bào, cho phép diễn ra và duy trì sự trao đổi chất. Khi không có nước, sự sống sẽ chấm dứt hoặc bước vào thời kỳ ngủ đông ở tế bào, khi đó hoạt động sinh hóa sẽ dừng lại [1]. Bảo quản tế bào và mô cũng dựa vào cơ chế như trên để hoạt động. Các vật mẫu được bảo quản ổn định bằng cách giữ lạnh hoặc đông lạnh. Tuy nhiên, việc duy trì và vận chuyển mẫu ở trạng thái đông lạnh rất tốn kém, trong khi sự cố tủ đông có thể làm mất hoàn toàn vật mẫu [2].

Do đó, nhiều nỗ lực đã được thực hiện để khắc phục những nhược điểm của phương pháp bảo quản hiện nay, trong đó đông khô (freeze-drying) được đề xuất như một phương pháp thay thế tiềm năng.

Về mặt hoạt động, đông khô là một phương pháp có thể kiểm soát sự khử nước các mẫu không bền bằng cách hút ẩm chân không. Mục đích chính là loại bỏ nước khỏi tế bào đến khi không còn hỗ trợ sự phát triển sinh học hoặc phản ứng hóa học [3].
 
Đông khô thường được sử dụng trong bảo quản dược phẩm, ví dụ protein và liposome, vì sau đó các mẫu có thể được lưu trữ và vận chuyển ở trạng thái khô ổn định ở nhiệt độ phòng. Đông khô không được sử dụng thường xuyên để bảo quản tế bào hoặc mô, bởi vì nó là một quá trình gây hại cho tế bào nhiều hơn so với đông lạnh. Trong quá trình đông khô, nước bị loại bỏ cũng như không giữ liên kết giữa các phân tử sinh học, từ đó ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng do chúng phụ thuộc vào sự hiện diện của nước lỏng và các tương tác với chúng. DNA và các protein cấu trúc như collagen có khả năng chống khô tương đối và thường có thể được đông khô mà không có tác dụng phụ. Tuy nhiên, một số protein có thể bị những thay đổi do không thể đảo ngược trong cấu trúc của chúng khi đông khô. Các liposome và lớp màng phospholipid kép có xu hướng bị hoà màng trong quá trình đông khô và màng của chúng không còn linh động. Do đó, các tế bào được đông khô chỉ giữ lại các đặc tính cụ thể, không có đầy đủ chức năng như trước. Ví dụ, tiểu cầu đông khô có thể được sử dụng để chữa lành vết thương tại chỗ và tinh trùng đông khô dùng trong thụ tinh thông qua ICSI.

2. Quy trình đông khô [3]

Đông khô gồm 3 bước:

Các mẫu thu được có thể được bảo quản ở điều kiện môi trường xung quanh và được hoàn nguyên bằng cách thêm nước, bất cứ khi nào cần. Để tăng tuổi thọ, bảo quản có thể được thực hiện trong điều kiện chân không hoặc trong điều kiện oxy hoặc độ ẩm tương đối thấp.

3. Đông khô tinh trùng

Mặc dù mối quan tâm về bảo quản tinh trùng đã có từ vài thế kỷ trước, nhưng việc bảo quản lạnh tinh trùng mới thành công lần đầu tiên vào năm 1949 khi Polge và cs., đã phát hiện ra các đặc tính bảo vệ lạnh của glycerol khi làm việc với tinh trùng của gà. Khám phá này đã dẫn đến các phương pháp thành công bảo quản ở nhiệt độ thấp của tinh trùng bò và người. Ban đầu, đá khô (-78,5 ⁰C) được sử dụng để đông lạnh và lưu trữ tinh trùng, điều này làm giảm khả năng di động của tinh trùng nhưng thời gian lưu trữ tăng lên. Năm 1963, vấn đề này đã được khắc phục bằng cách lưu trữ tinh trùng trong nitơ lỏng (LN2, -196 ⁰C). Những phát triển này trong đông lạnh tinh trùng đã tạo điều kiện thuận lợi cho cả việc điều trị vô sinh ở người và thụ tinh nhân tạo cũng như cải thiện di truyền của vật nuôi [3].

Dù bảo quản trong LN2 là phương pháp được lựa chọn thường xuyên, nhưng bảo quản tinh trùng ở nhiệt độ cao hơn (lý tưởng là ở nhiệt độ phòng) được ưu tiên hơn vì một số lý do. Nó sẽ làm giảm đáng kể chi phí và không gian lưu trữ, tạo thuận lợi cho việc vận chuyển mẫu và  giảm các chi phí liên quan, đồng thời tránh nguy cơ nhiễm chéo giữa các mẫu. Hơn nữa, LN2 không có sẵn ở một số quốc gia. Do đó, đã có sự quan tâm lâu dài đến các phương pháp bảo quản tế bào cho phép bảo quản mẫu ở nhiệt độ cao. Đông khô là đại diện cho một phương pháp như vậy [3].

Các nghiên cứu ban đầu về đông khô tinh trùng đã báo cáo những kết quả đáng khích lệ, bao gồm tới 50% khả năng di động sau khi bù nước ở tinh trùng gà, bò và thỏ. Tuy nhiên, các nghiên cứu tiếp theo đã không thu được thành công ban đầu và dẫn đến mất hứng thú với việc đông khô tinh trùng trong một thời gian. Một bước đột phá vào năm 1998 khi Wakayama và Yanagimachi chứng minh sự phát triển của chuột bình thường từ tế bào noãn được thụ tinh với tinh trùng đông khô, mở đầu cho một loạt các nghiên cứu được báo cáo thành công ở chuột, chuột đồng, thỏ, bò, ngựa, chó, khỉ, và người [3].

Trong quá trình bảo quản tinh trùng người bằng phương pháp đông khô, sự thiếu chuyển động trong các vật mẫu đã đông khô cho thấy màng sinh chất của tinh trùng bị tổn thương nghiêm trọng. Tác động của môi trường vật lý và hóa học của đông khô gây ra tổn thương cho các bào quan, cấu trúc lipid của màng sinh chất tế bào và các kênh dẫn nước trong màng. Sau khi đông khô, tinh trùng trở nên bất động trong tất cả các môi trường nuôi cấy. Khả năng sống của tinh trùng đã được báo cáo sau khi đông khô ở các loài động vật khác nhau. Một trong những bất thường xảy ra sau khi làm khô đông lạnh tinh trùng là dị thường về hình thái, đặc biệt là ở đuôi. Khi tinh trùng trở lại trạng thái đẳng trương sau khi tiếp xúc với dung dịch có độ thẩm thấu cao, làm cho đuôi xoắn và uốn cong quanh đầu tinh trùng. Ngoài ra, sự thay đổi hàm lượng nước trong quá trình mất nước của tế bào có thể dẫn đến hiện tượng xoắn đuôi. Acrosome tinh trùng cũng bị ảnh hưởng nhiều bởi quá trình đông khô trong tất cả các môi trường nuôi cấy, bất kể trạng thái tinh dịch hoặc nhiệt độ bảo quản, có thể được bảo quản trong kỹ thuật này [4].

Trong khi những nghiên cứu này cùng nhau chứng minh tính khả thi của việc đông khô tinh trùng của động vật có vú, những nỗ lực cải thiện quy trình này vẫn đang được tiến hành.

Kaneko và cs,. đã chứng minh rằng sự ổn định của tinh trùng chuột đông khô có thể được cải thiện bằng cách sử dụng dung dịch đông khô có đệm Tris có chứa phức chất như EGTA và EDTA. Các phức chất này giúp ức chế các endonuclease làm ảnh hưởng đến tính toàn vẹn của DNA [5]. Hơn nữa, dung dịch đông khô có tính kiềm nhẹ (pH 8) được chứng minh là tốt hơn các dung dịch gần trung tính (pH 7,4–6,0) hoặc có tính axit về tính toàn vẹn của nhiễm sắc thể và tiềm năng phát triển.

Ngoài ra, các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng việc bổ sung axit rosmarinic (RA), một chất chống oxy hóa tự nhiên, vào dung dịch đông khô sẽ cải thiện tính toàn vẹn DNA của tinh trùng sau khi đông khô [6]. Bên cạnh đó, kết quả của đông khô dường như cũng bị ảnh hưởng bởi tình trạng trưởng thành của tinh trùng. Các tinh trùng ở tinh hoàn chưa trưởng thành nên thiếu các liên kết disulfide mạnh trong chất nhiễm sắc, khiến nhân của chúng dễ bị tổn thương do stress liên quan đến quá trình đông khô [3].

Về thời gian bảo quản,  tinh trùng chuột đông khô ở 4⁰C trong tối đa 5 năm mà không bị suy giảm chức năng. Tuy nhiên, việc bảo quản tinh trùng đông khô trong thời gian dài ở nhiệt độ phòng vẫn còn nhiều khó khăn. Cả dữ liệu mô hình và thực nghiệm đều chỉ ra rằng tính toàn vẹn nhiễm sắc thể của tinh trùng đông khô bị ảnh hưởng khi bảo quản ở nhiệt độ phòng trong hơn 1 tháng. Giả thiết là nhân tinh trùng chứa nhiều đường và protein được ổn định ở trạng thái giống như thủy tinh khi loại bỏ nước bằng phương pháp đông khô. Tuy nhiên, điều này không đủ để bảo quản lâu dài ở nhiệt độ phòng khi môi trường xung quanh không ổn định ở trạng thái thủy tinh hóa. Thật vậy, tính toàn vẹn của DNA đã được cải thiện đã được báo cáo sau khi thêm trehalose vào dung dịch đông khô. Ngoài ra, trehalose cũng có thể bảo quản các vi ống trong quá trình đông khô tinh trùng [7].

Gần đây, một nghiên cứu trên Nature thực hiện ở tinh trùng cừu nhằm tối ưu quy trình đông khô. Nhóm tác giá đã chứng minh rằng việc đông lạnh ở nhiệt độ thấp dần trước khi đông khô bảo tồn sự ổn định cấu trúc và DNA so với quy trình hiện tại, đồng thời dẫn đến cải thiện đáng kể khả năng thụ tinh của chúng. Hơn nữa, nhóm đã làm nổi bật sự giảm khả năng sinh sản của tinh trùng sau thời gian bảo quản trong điều kiện chân không ở thời gian dài, do đó cần phải thực hiện điều kiện bảo quản và đóng gói phù hợp đối với tinh trùng đông khô [8].

Tóm lại, phương pháp đông khô tinh trùng đã có nhiều bước tiến mới, đầy tiềm năng. Các hoá chất, môi trường cũng như thời gian bảo quản được tối ưu hoá, nhưng vẫn cần các nghiên cứu sâu hơn để đưa đông khô thành phương pháp phổ biến trong hỗ trợ sinh sản người.

4. Kết luận

Công nghệ đông khô khắc phục những nhược điểm của phương pháp bảo quản lạnh hiện nay. Đây được xem là giải pháp ngân hàng sinh học thay thế, chi phí thấp cho ngân hàng gen về vô sinh ở người, chăn nuôi động vật và bảo tồn đa dạng sinh học. Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đông khô, vì vậy cần có các nghiên cứu sâu hơn để tìm ra các chiến lược kiểm soát các yếu tố này để duy trì tính toàn vẹn của DNA nói riêng và bảo tồn khả năng sinh sản nói chung.
 
TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Crowe JH, Carpenter JF, Crowe LM (1998) The role of vitrification in anhydrobiosis. Annu Rev Physiol 60:73–103
2. Olaciregui M, Gil L. Freeze-dried spermatozoa: A future tool? Reprod Domest Anim. 2017 Apr;52 Suppl 2:248-254. doi: 10.1111/rda.12838. Epub 2016 Oct 18. PMID: 27757990.
3. Wolkers, Willem F., and Harriëtte Oldenhof, eds. Cryopreservation and freeze-drying protocols. Humana Press, 2021.
4. Shahmoradi E, Halvaei I. Sperm freeze-drying; effects on sperm parameters. RJMS. 2021; 27 (11) :90-100
5. Kaneko T, Nakagata N (2006) Improvement in the long-term stability of freeze-dried mouse spermatozoa by adding of a chelating agent. Cryobiology 53:279–282
6. Olaciregui M, Luno V, Domingo P, Gonzalez N, Gil L (2017) In vitro develop- mental ability of ovine oocytes following intra- cytoplasmic injection with freeze-dried spermatozoa. Sci Rep 7:1096
7. Ito D, Wakayama S, Kamada Y, Shibasaki I, Kamimura S, Ooga M, Wakayama T (2019) Effect of trehalose on the preservation of freeze-dried mice spermatozoa at room tem- perature. J Reprod Dev. https://doi.org/10. 1262/jrd.2019-058
8. Palazzese, L., Anzalone, D.A., Turri, F. et al. Whole genome integrity and enhanced developmental potential in ram freeze-dried spermatozoa at mild sub-zero temperature.Sci Rep 10, 18873 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-76061-x