CNSH. Nguyễn Thị Thu Thảo - IVFMD Bình Dương
 
GIỚI THIỆU
Hiện nay, bảo quản tinh trùng người được triển khai rộng rãi, nhằm mục đích lưu trữ dự phòng cho điều trị thụ tinh trong ống nghiệm, thành lập ngân hàng tinh trùng hay cho mục đích bảo tồn khả năng sinh sản với những trường hợp trước khi điều trị bệnh lý ác tính hay để sử dụng trong tương lai [1].
 
PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN TINH TRÙNG
Hiện nay, phương pháp phổ biến để bảo quản tinh trùng người là bảo quản lạnh. Bảo quản lạnh là một quá trình vật lý liên quan đến việc sử dụng nhiệt độ thấp để tạm ngưng các phản ứng sinh hóa và hoạt động trao đổi chất diễn ra trong tế bào, nhằm bảo tồn cấu trúc và chức năng của tế bào. Nhờ đó có thể bảo quản tế bào trong thời gian rất dài [2]. Hiện nay có hai phương pháp bảo quản lạnh tinh trùng phổ biến là đông lạnh chậm và thuỷ tinh hoá.
 
Bên cạnh những lợi ích của phương pháp bảo quản lạnh mang lại thì quá trình đông lạnh cũng như rã đông tạo ra những thay đổi lớn trong tế bào gây ra tác động tiêu cực lên khả năng sống cũng như các chức năng của tế bào và mô. Quá trình làm lạnh sẽ dẫn đến sự đóng băng nước nội bào và ngoại bào, từ đó làm tăng nồng độ các chất hòa tan trong pha lỏng còn lại. Điều này dẫn đến sự mất cân bằng thẩm thấu giữa tế bào và môi trường, nước từ trong tế bào chất bị rút ra ngoài, tế bào bị co nhỏ, nếu tế bào bị co nhỏ quá mức thì sự tổn thương màng lipoprotein xảy ra sẽ không thể phục hồi. Mặt khác, sự hình thành các tinh thể đá nội bào còn gây ra các tổn thương cơ học lên cấu trúc màng tế bào và các bào quan bên trong [3]. Để hạn chế những tổn thương này, các chất bảo vệ đông lạnh (Cryoprotectant agent - CPA) được bổ sung vào môi trường đông lạnh tinh trùng [4].
 
CPA là những chất hòa tan được trong nước và gây cản trở sự chuyển trạng thái giữa nước và đá. Chúng tương tác với những phân tử sinh học với vai trò thay thế nước trong tế bào nhờ đó hạn chế sự hình thành các tinh thể đá bên trong tế bào khi nhiệt độ hạ thấp. Và một vai trò khác của CPA cũng không kém phần quan trọng là bảo vệ tế bào khi ở nhiệt độ thấp. Bên cạnh lợi ích CPA mang lại thì hầu hết CPA đều có khả năng gây độc tế bào và độc tính của CPA tỉ lệ thuận với nồng độ và thời gian tiếp xúc, đặc biệt là ở nhiệt độ sinh lý [4].
 
Đông lạnh chậm
Đông lạnh chậm là quá trình làm lạnh tinh trùng dần dần trong hai hoặc ba bước, bằng phương pháp thủ công hoặc tự động. Nguyên lý của đông lạnh chậm là điều khiển tốc độ làm lạnh để đưa tế bào từ nhiệt độ sinh lý đến nhiệt độ rất thấp (khoảng -80^oC). Tốc độ làm lạnh tối ưu được chứng minh của mẫu từ nhiệt độ phòng đến 5°C là 0,5–1°C/phút; từ 5°C đến −80°C là 1–10°C/phút. Với phương pháp này mẫu sẽ tiếp xúc với môi trường chứa CPA với nồng độ tăng dần, đồng thời giảm nhiệt độ của mẫu theo từng bước và sau đó nhúng mẫu vào nitơ lỏng ở -196°C [5].
 
Thuỷ tinh hoá
Thuỷ tinh hoá là quy trình đông lạnh không cân bằng với sự tăng tốc độ làm lạnh và tăng nồng độ CPA. Do đó, quy trình này sẽ dẫn đến không hình thành tinh thể đá bên trong và bên ngoài tế bào, mà chất lỏng sẽ chuyển thành dạng rắn vô định hình tương tự như thủy tinh. Quy trình này bao gồm việc đưa các tế bào vào môi trường có CPA, sau đó cho chúng tiếp xúc trực tiếp với nitơ lỏng ở -196°C, do đó tốc độ hạ nhiệt độ sẽ đạt khoảng 20.000^oC/phút [2].
 
XU HƯỚNG MỚI TRONG BẢO QUẢN TINH TRÙNG NGƯỜI
Thủy tinh hoá không dùng chất bảo vệ đông lạnh
Các nghiên cứu cho thấy phương pháp thủy tinh hóa có sự cải thiện đáng kể về khả năng sống và chức năng của tế bào sau rã đông bằng cách loại bỏ tác hại của việc hình thành tinh thể đá so với phương pháp đông lạnh chậm. Tuy nhiên, nồng độ CPA cao gây ra độc tính và stress thẩm thấu cho các tế bào và mô. Bên cạnh đó, quá trình thủy tinh hóa sử dụng thể tích mẫu nhỏ (<1 μl) đã được chứng minh làm tăng đáng kể tốc độ làm lạnh và do đó làm giảm nồng độ CPA cần thiết sử dụng [6, 7].
 
Do đó, hiện nay xu hướng thuỷ tinh hoá không dùng chất bảo vệ đông lạnh được hướng tới. Với quy trình này, tinh trùng sẽ được lọc, sau đó nhúng thẳng trực tiếp tinh trùng đã lọc rửa vào nitơ lỏng hoặc hơi nitơ lỏng. Để bảo quản lạnh thành công mà không cần sử dụng CPA thì phải thông qua quá trình thủy tinh hóa ở tốc độ rã đông rất nhanh. Điều này đạt được bằng cách cho một lượng nhỏ huyền phù tinh trùng đông lạnh vào môi trường làm ấm, hoặc một lượng lớn huyền phù tinh trùng vào môi trường làm ấm có khuấy trộn. Lúc này tốc độ rã đông sẽ đạt khoảng hàng trăm nghìn độ C/phút [6, 7].
 
Hiện nay, có nhiều nghiên cứu về hiệu quả của xu hương mới này. Nghiên cứu vào năm 2005 của Vladimir Isachenko đã so sánh phương pháp này với 4 dụng cụ là Cryoloops, droplets, open-pulled straws và open-standard straws; kết quả cho thấy tinh trùng giảm khoảng 40% độ di động, điều này cho thấy cả 4 dụng cụ với phương pháp này đều phù hợp để sử dụng trong công nghệ hỗ trợ sinh sản [6]. Nghiên cứu năm 2019 của Medhat Amer cho thấy tỷ lệ phục hồi khả năng di động cải thiện ở thuỷ tinh hoá không CPA so với đông lạnh chậm thông thường [8]. Nghiên cứu năm 2015 của M Slabbert so sánh thuỷ tinh hoá không CPA với đông lạnh chậm; kết quả cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về độ di động (P > 0,05); điện thế màng ty thể cao hơn đáng kể (P < 0,001) và tỷ lệ phân mảnh DNA thấp hơn (P < 0,01) ở phương pháp thuỷ tinh hoá không CPA so với đông lạnh chậm [9]. Ngoài ra nghiên cứu năm 2012 của Vladimir Isachenko cho thấy sử dụng tinh trùng đông lạnh bằng phương pháp thuỷ tinh hoá không CPA đã sinh ra 2 em bé khoẻ mạnh [10]. Và 1 nghiên cứu năm 2019 của Emilia Spisa với tinh trùng TESE và MESA cho thấy chất lượng tinh trùng khi sử dụng phương pháp thuỷ tinh hoá không CPA cao hơn đông lạnh chậm; và sử dụng tinh trùng từ phương pháp thuỷ tinh hoá không CPA đã sinh ra 3 em bé khỏe mạnh. Đây là nghiên cứu đầu tiên sử dụng tinh trùng TESE và MESA với phương pháp thuỷ tinh hoá không CPA [11]. Những nghiên cứu này cho thấy thuỷ tinh hoá không CPA có thể có tiềm năng áp dụng thành công trong hỗ trợ sinh sản.
 
Đông khô tinh trùng
Đông khô đã được đề xuất như một phương pháp thay thế để bảo quản tinh trùng nhằm khắc phục những nhược điểm của phương pháp bảo quản đông lạnh hiện nay như chi phí bảo quản đông lạnh cao, các vấn đề liên quan đến vận chuyển nguyên liệu đông lạnh và nguy cơ mất mát toàn bộ các thùng trữ đông [12].
 
Đông khô liên quan tới "Sự chuyển pha nước”. Đối với “Chuyển pha bình thường” thì ở mực nước biển (nơi áp suất bằng 1 atm), các phân tử nước chuyển từ thể rắn sang thể lỏng (tan chảy) nếu nhiệt độ của chúng tăng lên trên điểm đóng băng của mực nước biển (0^oC) và sau đó chuyển sang thể hơi (bay hơi) nếu nhiệt độ của chúng tăng lên trên nhiệt độ sôi của mực nước biển (100^oC). Đối với “Chuyển pha thăng hoa” thì nếu nhiệt độ nước cao hơn điểm đóng băng trong khi áp suất khí quyển được duy trì dưới 0,006 atm (6,1 hPa), các phân tử nước có thể đủ ấm để tan băng. Tuy nhiên, trong trường hợp không có đủ áp suất để hình thành chất lỏng, các phân tử nước sẽ chuyển trực tiếp sang pha hơi. Dựa trên nguyên lý này mà phương pháp đông khô ra đời. Động học của áp suất chân không và nhiệt độ bình chứa được lập trình cho quy trình đông khô tinh trùng trong máy đông khô. Các bình chứa mẫu đông lạnh được đặt trên giá có thể kiểm soát được nhiệt độ trong buồng sấy, pha lỏng có thể tránh được bằng cách duy trì nhiệt độ đủ thấp dưới áp suất thấp [12].
 
Đối với mẫu tinh trùng, bước đầu tiên của quá trình đông khô là bước đông lạnh, mẫu sẽ được điều chỉnh về mật độ khoảng 10×10⁶ tinh trùng/100 μL dung dịch đông khô. Cho khoảng 100 μl vào các ống 1,5 mL và giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó, tinh trùng được làm lạnh bằng cách thả vào nitơ lỏng/trong hơi nitơ lỏng (khoảng -80°C trong 1 giờ) bằng cách giữ các ống ở khoảng cách 5 cm so với bề mặt nitơ lỏng trước khi thả vào nitơ lỏng. Mẫu đông lạnh ngay lập tức được đưa vào đặt trong bình đông lạnh được làm lạnh trước trong máy đông khô, trước đó đã ổn định ở nhiệt độ -30°C và áp suất 0,37 hPa, để diễn ra quá trình đông khô sơ cấp. Quá trình này diễn ra với sự tăng nhiệt độ dần của bình chứa mẫu cùng với sự tăng nhiệt độ của mẫu; trong đó, nhiệt độ mẫu thấp hơn bình chứa để duy trì áp suất hơi thấp xung quanh vẫn ở 0,37 hPa. Hơi thăng hoa được “giữ lại” vào ống chứa mẫu. Sau đó, diễn ra quá trình làm khô thứ cấp với sự giảm nhiệt độ một chút và giảm áp suất xuống khoảng 0,001 hPA để quá trình đông khô triệt để hơn. Sau 12-16 giờ đông khô, các ống chứa mẫu được đậy kỹ bằng lá nhôm và bảo quản trong 1-3 tháng trong chân không ở nhiệt độ phòng hoặc ở 4°C. Khi sử dụng thì sẽ thực hiện giai đoạn bù nước cho mẫu đông khô. Các mẫu tinh trùng đông khô được bù nước bằng cách thêm 100 μL nước milli-Q/môi trường ở nhiệt độ phòng để hoàn nguyên lại trạng thái trong dung dịch [12].
 
Một hạn chế của quá trình đông khô là tinh trùng đông khô sau khi bù nước sẽ mất khả năng di động. Điều này có thể do những stress liên quan đến quá trình làm khô hoặc bù nước; nhưng nguyên nhân chính xác gây ra thiệt hại cho các tế bào trong quá trình đông khô vẫn chưa được biết, nhưng vì sự di động bị mất đi, rất có thể có tổn thương màng tế bào hoặc các cơ chế gây hại khác có liên quan. Sự di động là yêu cầu thiết yếu để hoàn thành quá trình thụ tinh sinh lý, nhưng vì DNA vẫn còn nguyên vẹn, nên mẫu tinh trùng đông khô vẫn có thể sử dụng để thực hiện hỗ trợ sinh sản với các kỹ thuật tương đối phức tạp như ICSI kèm theo phương pháp lựa chọn tinh trùng bất động. Bên cạnh đó, mặc dù có hạn chế về sự di động nhưng về mặt lý thuyết, các nhà nghiên cứu cho rằng tinh trùng đông khô có thể duy trì các chức năng và khả năng của chúng để tương tác với tế bào chất của noãn sau khi bảo quản trong thời gian dài ở nhiệt độ tủ lạnh. Tuy nhiên, việc đông khô thành công tinh trùng người để dẫn đến sự thành công lâm sàng vẫn còn nhiều thử thách và cần nghiên cứu nhiều hơn nữa. Hiện tại đông khô tinh trùng mới được thực hiện và thành công ở động vật ví dụ như bò [13].
 
KẾT LUẬN
Với những tác động tiêu cực của quá trình đông lạnh (đông lạnh chậm và thuỷ tinh hoá) lên khả năng sống cũng như chức năng của tế bào và mô, phương pháp thuỷ tinh hoá không dùng chất bảo vệ đông lạnh và đông khô đang là xu hướng bảo quản tinh trùng người ở hiện tại cũng như tương lai.
 
Tài liệu tham khảo
[1] Yogev L, kleiman SE, Shabtai E và cộng sự. Long-term cryostorage of sperm in a human sperm bank does not damage progressive motility concentration. Hum Reprod. 2010. 25(5):1097-1103.
[2] Schulz M, Risopatrón J, Uribe P và cộng sự. Human sperm vitrification: A scientific report. Andrology. 2020. 8(6):1642-1650.
[3] Amarin ZO. A flexible protocol for cryopreservation of pronuclear and cleavage stage embryos created by conventional in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2004.117(2):189-93.
[4] Best BP. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Res. 2015.18(5):422-436.
[5] Di Santo M, Tarozzi N, Nadalini M và cộng sự. Human Sperm Cryopreservation: Update on Techniques, Effect on DNA Integrity, and Implications for ART. Adv Urol. 2012.
[6] Isachenko V, Isachenko E, Montag M và cộng sự. Clean technique for cryoprotectant-free vitrification of human spermatozoa. Reprod Biomed Online. 2005. 10(3):350-4.
[7] Chen X, Ma Y, Zou S và cộng sự. Comparison and outcomes of nonobstructive azoospermia patients with different etiology undergoing MicroTESE and ICSI treatments. Transl Androl Urol. 2019. 8(4):366-373.
[8] Amer M, Ismail N, GamalEl Din SF và cộng sự. Effect of cryoprotectant-free vitrification versus conventional freezing on human testicular sperm motility: a prospective comparative study. Hum Fertil (Camb). 2019.
[9] Slabbert M, du Plessis SS, Huyser C. Large volume cryoprotectant-free vitrification: an alternative to conventional cryopreservation for human spermatozoa. Andrologia. 2015. 47(5):594-9.
[10] Isachenko V, Isachenko E, Petrunkina AM và cộng sự. Human spermatozoa vitrified in the absence of permeable cryoprotectants: birth of two healthy babies. Reprod Fertil Dev. 2012. 24(2):323-6.
[11] Spis E, Bushkovskaia A, Isachenko E và cộng sự. Conventional freezing vs. cryoprotectant-free vitrification of epididymal (MESA) and testicular (TESE) spermatozoa: Three live births. Cryobiology. 2019. 90:100-102.
[12] Hochi S, Abdalla H, Hara H và cộng sự. Challenging endeavour for preservation of freeze-dried mammalian spermatozoa. J Reprod Dev. 2011. 57(5):557-63.
[13] Arav A, Saragusty J. Directional freezing of sperm and associated derived technologies. Anim Reprod Sci. 2016.169:6-13.

Từ khóa: Xu hướng mới hiện nay trong bảo quản tinh trùng người trong hỗ trợ sinh sản