ThS. Nguyễn Huỳnh Cẩm Tú – IVF Tâm Anh

Giới thiệu
Tinh dịch đồ (TDĐ) với các chỉ số như mật độ, độ di động và hình thái tinh trùng (TT) là công cụ thường được sử dụng trong đánh giá khả năng sinh sản nam. Tuy nhiên, ở một tỷ lệ lớn nam giới vô sinh có TDĐ bình thường, những chỉ số này không đủ để giải thích nguyên nhân vô sinh, đặt ra nhu cầu về các xét nghiệm chức năng TT chuyên sâu hơn nhằm phân tích đặc điểm nhân TT. Về mặt sinh học phân tử, DNA của TT được đóng gói chặt chẽ nhờ protamine, giúp bảo vệ vật liệu di truyền và hỗ trợ sự di chuyển. Bất thường trong quá trình đóng gói chromatin, chẳng hạn như giảm protamine hoặc tổn thương DNA, đặc biệt là tổn thương mạch đơn, đã được chứng minh là ảnh hưởng tiêu cực đến khả năng sinh sản và sự phát triển phôi. Các phương pháp hiện tại như nhuộm huỳnh quang CMA3 hay AAB vẫn còn hạn chế do chỉ khảo sát một số lượng nhỏ TT và phụ thuộc nhiều vào đánh giá chủ quan. Gần đây, các kỹ thuật đánh dấu trực tiếp vùng DNA dễ tiếp cận (đại diện cho các vùng chromatin chưa được đóng gói hoàn chỉnh) như ATAC-seq, ATAC-see và NicE-view đã được phát triển. Trong đó, NicE-view nổi bật với khả năng đánh dấu huỳnh quang các vùng chromatin mở ở cấp độ tế bào bằng enzym endonuclease mà không bị nhiễu bởi DNA ngoài tế bào. Tuy nhiên, ứng dụng của NicE-view trên TT người vẫn chưa được thực hiện. Do đó, nghiên cứu này sử dụng NicE-view kết hợp với phân tích hình ảnh để định lượng mức độ tiếp cận DNA (levels of accessible DNA - LAD) trên hàng triệu TT của nam giới vô sinh có TDĐ bình thường, từ đó phân nhóm TT theo đặc tính chromatin và đánh giá mối liên hệ với khả năng phát triển phôi.
Phương pháp
Nghiên cứu thực nghiệm được tiến hành từ tháng 4 năm 2020 đến tháng 12 năm 2023, tuyển chọn 60 nam giới vô sinh có TDĐ nằm trong giới hạn bình thường. Trong đó, 40 người từng thực hiện ít nhất một chu kỳ hỗ trợ sinh sản, được chia thành 2 nhóm theo kết cục phát triển phôi: nhóm tỷ lệ phôi nang thấp (low blastocyst growth rate - LBGR, n=20) với ≤1 phôi nang, và nhóm tỷ lệ phôi nang cao (low blastocyst growth rate - HBGR, n=20) với ≥50% phôi nang. Ngoài ra, nhóm nam giới vô sinh trước đây nhưng đã có thai tự nhiên (naturally occurring pregnancy - NATP, n=20) cũng được đưa vào so sánh. TT sau khi được thu thập được xử lý bằng 2 cách: rửa loại bỏ tinh tương hoặc “swim-up”. Sau đó, mẫu được áp dụng kỹ thuật NicE-view để đánh giá LAD thông qua kính hiển vi đồng tiêu. Hơn 3 triệu TT được ghi nhận và phân tích bằng thuật toán hình ảnh tự động, cho phép định lượng mức độ huỳnh quang tại từng nhân TT. Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng thực hiện so sánh giữa tín hiệu NicE-view với kỹ thuật nhuộm huỳnh quang CMA3. Phương pháp NicE-view được cải tiến bằng bước tiền xử lý với enzym T4 DNA ligase (T4 NicE-view) nhằm loại bỏ tín hiệu gây nhiễu do đứt gãy DNA mạch đơn, giúp tăng độ đặc hiệu cho vùng chromatin mở. Các dữ liệu được phân tích để xác định sự phân bố tín hiệu giữa các nhóm đối tượng và mối liên hệ giữa đặc điểm nhân TT với khả năng phát triển phôi.
Kết quả
Lựa chọn cá nhân có TT ảnh hưởng khác nhau đến năng lực phát triển phôi
Phân tích đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng giữa các nhóm đối tượng cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tuổi, chỉ số khối cơ thể và khoảng cách hậu môn–sinh dục. Tương tự, các thông số nội tiết (LH, FSH, testosterone) và đặc điểm buồng trứng của vợ như số lượng nang thứ cấp cũng đồng đều giữa các nhóm, giúp loại trừ ảnh hưởng từ yếu tố noãn trong đánh giá khả năng phát triển phôi. Mặc dù các chỉ số TDĐ nhìn chung không khác biệt đáng kể, nhóm LBGR ghi nhận tỷ lệ TT di động tiến tới thấp hơn so với các nhóm còn lại. Tuy nhiên, phần lớn nam giới trong nhóm này vẫn có chỉ số di động tiến tới vượt ngưỡng tham chiếu của WHO 2010, cho thấy sự suy giảm chỉ ở mức nhẹ. Phát hiện trên cho thấy TT có thể đóng vai trò then chốt trong việc ảnh hưởng đến năng lực phát triển phôi, ngay cả khi TDĐ nằm trong giới hạn bình thường nên cần có các xét nghiệm đánh giá sâu hơn về chức năng nhân TT.
NicE-view phát hiện 2 phân nhóm chính của TT người
Để khảo sát đặc điểm chromatin trong nhân TT, nhóm nghiên cứu đã tối ưu hóa kỹ thuật NicE-view thành T4 NicE-view nhằm đánh dấu các vùng DNA dễ tiếp cận trên mẫu TT người đã cố định và đông khô. Kết quả cho thấy NicE-view và T4 NicE-view đều tạo ra phân bố tín hiệu huỳnh quang dạng 2 đỉnh rõ rệt, phản ánh sự tồn tại của 2 phân nhóm TT với LAD khác nhau. Ngược lại, kỹ thuật Nick translation chỉ tạo ra tín hiệu thấp, tập trung ở một nhóm nhỏ TT. Đáng chú ý, các mẫu được chọn lọc bằng “swim-up” có tỷ lệ TT mang tín hiệu NicE-view cao nhiều hơn so với mẫu toàn phần, dù cường độ trung bình thấp hơn đôi chút, cho thấy phương pháp này ưu tiên lựa chọn các TT có vùng chromatin dễ tiếp cận hơn. Phân tích mối tương quan giữa đặc điểm nhân như diện tích, hình dạng và cường độ huỳnh quang DAPI cho thấy LAD liên quan mật thiết đến diện tích nhân nhưng không phụ thuộc đáng kể vào hình dạng.
Sự phân mảnh DNA và chỉ số NicE-view khác biệt giữa các cá nhân và có liên quan đến thông số sinh sản
Phân tích mức độ đánh dấu NicE-view và tình trạng phân mảnh DNA (DNA fragmentation - DF) trong các mẫu TT cho thấy sự biến thiên rõ rệt giữa các cá nhân, đặc biệt ở nhóm LBGR. Một số mẫu trong nhóm này ghi nhận mức độ DF cao trong mẫu xuất tinh, nhưng phần lớn được cải thiện sau “swim-up”. Đồng thời, nhóm LBGR cũng có xu hướng LAD cao hơn so với các nhóm NATP và HBGR. Sau “swim-up”, tất cả các nhóm đều ghi nhận sự gia tăng LAD, phản ánh xu hướng chọn lọc của phương pháp này đối với các TT có đặc điểm nhân dễ tiếp cận. Nhằm phân tích sâu hơn, TT được phân loại thành 2 nhóm dựa trên ngưỡng huỳnh quang: NicE-view-cao và NicE-view-thấp. Chỉ khoảng 10% mẫu tinh dịch thuộc nhóm NicE-view-cao, chủ yếu đến từ nhóm LBGR; trong khi đó, tỷ lệ này tăng lên đến 40% sau “swim-up”, không còn khác biệt rõ giữa các nhóm. Ngoài ra, tỷ lệ TT NicE-view-cao tương quan chặt chẽ với kết quả T4 NicE-view, cho thấy tính nhất quán giữa 2 kỹ thuật. Ở mẫu đã chọn lọc, tỷ lệ DF cũng cho thấy mối tương quan dương với LAD, trong khi mối liên hệ này không rõ ràng ở mẫu chưa chọn lọc. Các phân tích bổ sung ghi nhận sự tương quan giữa mức độ tổn thương DNA và kết quả nhuộm TUNEL trong mẫu tinh dịch, nhưng mối liên hệ này bị giảm sau “swim-up”. Đặc biệt, tỷ lệ TT NicE-view-cao có xu hướng tỷ lệ nghịch với các thông số TDĐ như hình thái, di động tiến tới và mật độ, gợi ý rằng LAD cao có thể phản ánh bất thường về chức năng nhân TT ngay cả khi các chỉ số TDĐ nằm trong giới hạn bình thường.
Phân loại đối tượng nghiên cứu dựa trên LAD của TT
Dựa trên dữ liệu từ kỹ thuật NicE-view, nhóm nghiên cứu đã tiến hành phân loại lại các đối tượng tham gia bằng cách đánh giá tỷ lệ TT mang đặc điểm NicE-view-cao đại diện cho LAD cao. Kết quả cho thấy có sự phân bố không đồng đều giữa các cá nhân: trong mẫu tinh dịch, chỉ khoảng 10% trường hợp có NicE-view-cao, trong đó phần lớn rơi vào nhóm LBGR. Sau “swim-up”, tỷ lệ này tăng lên đáng kể, với khoảng 40% trường hợp có NicE-view-cao, đồng thời sự khác biệt giữa các nhóm LBGR, HBGR và NATP không còn rõ rệt. Những kết quả này cho thấy LAD không chỉ khác biệt giữa các cá nhân mà còn bị ảnh hưởng bởi phương pháp xử lý TT, đặc biệt là khả năng chọn lọc của kỹ thuật “swim-up” đối với các TT có đặc tính chromatin mở. Ngoài ra, sự tương quan cao giữa kết quả NicE-view và T4 NicE-view tiếp tục củng cố giá trị của các kỹ thuật này trong phân tích chromatin TT. Bên cạnh đó, các chỉ số về DF và các thông số TDĐ như mật độ, hình thái và độ di động cũng cho thấy mối liên hệ nhất định với tỷ lệ TT NicE-view-cao, gợi ý rằng đặc tính nhân TT phản ánh qua LAD có thể là yếu tố sinh học quan trọng giúp phân loại lại các nhóm bệnh nhân vô sinh nam mà TDĐ thông thường không phát hiện được.
Mối liên hệ giữa kỹ thuật NicE-view và các phương pháp khác trong đánh giá mức độ tiếp cận DNA
Nhằm đánh giá giá trị so sánh và bổ sung của kỹ thuật NicE-view trong phân tích LAD của TT, nhóm nghiên cứu đã thực hiện đối chiếu kết quả NicE-view với 2 phương pháp phổ biến khác là nhuộm CMA3 và ATAC-see. Kỹ thuật FACS được sử dụng để phân loại TT theo mức độ bắt màu CMA3 phản ánh sự thiếu hụt protamine và thường liên quan đến chất lượng nhân TT kém. Kết quả cho thấy ở phần lớn mẫu (5/6 trường hợp), phân nhóm TT CMA3-cao có tín hiệu NicE-view cao hơn so với nhóm CMA3-thấp, cho thấy sự tương quan dương giữa 2 phương pháp. Tuy nhiên, sự tồn tại của phân bố 2 đỉnh ở cả 2 nhóm cho thấy NicE-view và CMA3 không hoàn toàn trùng lặp mà có thể phản ánh những khía cạnh sinh học khác nhau của chromatin. Bên cạnh đó, nhóm nghiên cứu cũng áp dụng kỹ thuật ATAC-see giữa mẫu toàn phần và mẫu “swim-up” cho thấy phần lớn các trường hợp (4/5) có sự gia tăng tín hiệu sau chọn lọc, phù hợp với xu hướng phát hiện nhiều chromatin mở hơn. Tuy nhiên, ATAC-see không tạo được phân bố tín hiệu 2 đỉnh rõ ràng và cường độ tín hiệu thấp hơn đáng kể so với NicE-view, cho thấy độ nhạy thấp hơn hoặc phản ánh một đặc tính chromatin khác. Nhìn chung, NicE-view có mối liên hệ một phần với các kỹ thuật đánh giá chromatin truyền thống, nhưng vẫn cung cấp thông tin sinh học độc lập và có độ phân giải cao hơn, giúp phân biệt rõ ràng các phân nhóm TT trong mẫu nên có thể mang lại giá trị ứng dụng cao trong đánh giá chức năng nhân TT ở nam giới vô sinh.
Không phải tất cả TT có LAD cao đều mang tổn thương DNA mạch đơn
Mặc dù dữ liệu trước đó cho thấy có mối tương quan dương giữa tỷ lệ TT NicE-view-cao và kết quả dương tính với kỹ thuật Nick translation (chỉ dấu tổn thương DNA mạch đơn), nhóm nghiên cứu đặt câu hỏi liệu 2 đặc điểm này có thực sự phản ánh cùng một nhóm TT hay không. Phân tích chi tiết ở từng mẫu cho thấy sự tương quan rất mạnh giữa NicE-view-cao và T4 NicE-view-cao trong cả mẫu tinh dịch và mẫu đã lọc rửa, khẳng định rằng 2 kỹ thuật này nhất quán trong việc đánh dấu vùng chromatin dễ tiếp cận. Tuy nhiên, không ghi nhận được mối liên hệ chặt chẽ giữa NicE-view-cao và Nick translation trong mẫu toàn phần, và chỉ thấy mối tương quan ở mẫu “swim-up” của các nhóm có kết cục sinh sản tốt hơn (NATP và HBGR). Điều này gợi ý rằng mối liên hệ giữa mức độ mở của chromatin và tổn thương DNA mạch đơn có thể thay đổi tùy theo đặc điểm sinh sản của từng nhóm đối tượng. Để kiểm định trực tiếp giả thuyết này, nhóm nghiên cứu thực hiện thí nghiệm nhuộm kép, trong đó đánh dấu trước các đứt gãy DNA bằng dATP gắn FITC, sau đó tiếp tục thực hiện NicE-view với dATP gắn huỳnh quang đỏ. Kết quả ghi nhận sự tồn tại của một số TT mang đồng thời cả tín hiệu tổn thương DNA và chromatin mở, nhưng cũng có nhiều TT chỉ thể hiện một trong hai đặc điểm. Những quan sát này xác nhận rằng DNA nicks và LAD cao là hai đặc tính sinh học riêng biệt, dù có thể cùng tồn tại trong một số tế bào và cần được đánh giá độc lập để hiểu chính xác hơn về chất lượng nhân TT trong bối cảnh vô sinh nam.
Thảo luận
Nghiên cứu này đã chứng minh rằng ngay cả ở nam giới vô sinh có TDĐ bình thường vẫn tồn tại các phân nhóm TT với LAD khác nhau, phản ánh sự không đồng nhất về cấu trúc chromatin nhân. Thông qua kỹ thuật NicE-view, một công cụ mới có độ nhạy cao và khả năng định lượng trực tiếp mức độ LAD ở quy mô lớn, nhóm nghiên cứu đã xác định rằng tỷ lệ TT LAD cao có liên quan đến tỷ lệ phát triển phôi thấp. Đặc tính này có thể phản ánh tình trạng đóng gói chromatin chưa hoàn chỉnh, giữ lại histone hoặc tổn thương DNA mạch đơn, dù các yếu tố này là độc lập và không hoàn toàn trùng lắp. Thí nghiệm nhuộm kép xác nhận rằng không phải tất cả TT có vùng chromatin mở đều mang tổn thương DNA, nhấn mạnh tầm quan trọng của việc đánh giá riêng biệt hai đặc điểm này. Bên cạnh đó, so với các kỹ thuật truyền thống như CMA3 hay ATAC-see, NicE-view tỏ ra vượt trội trong khả năng phân nhóm TT và cung cấp thông tin sinh học độc lập về cấu trúc nhân. Đặc biệt, kết quả cũng cho thấy rằng các chỉ số TDĐ nằm trong giới hạn bình thường không loại trừ hoàn toàn các bất thường ở cấp độ nhân, làm nổi bật nhu cầu lâm sàng đối với các xét nghiệm chức năng bổ sung trong chẩn đoán vô sinh nam không rõ nguyên nhân. Ngoài ra, kỹ thuật “swim-up” làm tăng tỷ lệ TT NicE-view-cao cho thấy kỹ thuật này có thể ưu tiên lựa chọn các TT mang chromatin mở, nhưng tác động sinh học của hiện tượng này là có lợi hay bất lợi vẫn cần được làm rõ. Cuối cùng, mặc dù nghiên cứu còn hạn chế về cỡ mẫu trong một số nhóm và chưa đánh giá kết cục lâm sàng như tỷ lệ có thai hoặc sinh sống, nhưng các phát hiện đã mở ra hướng tiếp cận mới đầy tiềm năng trong đánh giá chất lượng nhân TT, góp phần cải thiện chẩn đoán và cá thể hóa điều trị trong y học sinh sản nam giới.
Từ khóa: sự sinh sản ở người, tinh trùng, khả năng tiếp cận nhiễm sắc thể, phôi tiền làm tổ, ART, IVF, ICSI
Tài liệu tham khảo: Gill ME, Fischer M, De Geyter C, Peters AHFM. Normozoospermic infertile men possess subpopulations of sperm varying in DNA accessibility, relating to differing reproductive outcomes. Hum Reprod. 2025 Jul 1;40(7):1266-1281. doi: 10.1093/humrep/deaf081. PMID: 40375809; PMCID: PMC12222617.