CNSH. Lê Thị Quỳnh – IVFMD SIH - Bệnh viện Phụ sản Quốc tế Sài Gòn

TỔNG QUAN
Sau kích thích buồng trứng, khoảng 15% noãn thu được chưa trưởng thành (giai đoạn GV hoặc MI) và thường bị loại bỏ. Tuy nhiên, tỷ lệ noãn non cao có thể ảnh hưởng đến kết quả chu kỳ IVF. Để giải quyết vấn đề này, kỹ thuật rescue IVM (rIVM) đang nổi lên như một giải pháp tiềm năng.
Rescue IVM khác biệt với IVM thông thường ở chỗ nó áp dụng cho noãn non không có cumulus, được thu nhận sau khi buồng trứng đã được kích thích và kích hoạt phóng noãn (bằng GnRH-a/hCG). Mặc dù có những nghi ngờ ban đầu về tiềm năng sinh sản của noãn GV, nhiều báo cáo lâm sàng đã ghi nhận các ca sinh nở khỏe mạnh từ noãn được rescue.
Hiệu quả của rIVM phụ thuộc vào nhiều yếu tố, đặc biệt là môi trường nuôi cấy. Hầu hết các môi trường IVM hiện có được thiết kế cho phức hợp cumulus-noãn (COC) từ buồng trứng kích thích nhẹ hoặc không kích thích, điều này không phù hợp với rIVM (noãn GV đã tách cumulus, thu được sau kích thích buồng trứng và kích hoạt phóng noãn). Do đó, nghiên cứu này nhằm mục đích kiểm tra các môi trường nuôi cấy phức hợp khác nhau để tìm ra môi trường tối ưu cho rIVM.
Thời gian nuôi cấy cũng là một yếu tố quan trọng; thời gian càng dài (đến 30 hoặc 48 giờ) thường cho tỷ lệ rescue cao hơn. Tuy nhiên, các noãn bào đạt đến giai đoạn MII trong vòng 24 giờ thường có tiềm năng phát triển tốt hơn.
Mục tiêu của nghiên cứu hiện tại là đánh giá tỷ lệ rescue và khả năng tế bào chất ban đầu của noãn MII được rescue (r-MII) sau khi rGV-IVM trong mười một môi trường thương mại có sẵn, nhằm tìm ra môi trường nuôi cấy lý tưởng cho quy trình này.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Nghiên cứu này được thực hiện tại IVI Valencia từ tháng 2 năm 2019 đến tháng 3 năm 2020, bao gồm hai giai đoạn chính nhằm đánh giá tiềm năng của kỹ thuật rIVM đối với noãn GV chưa trưởng thành.
Giai đoạn 1: Đánh giá tỷ lệ trưởng thành và động học nhân (1570 noãn GV)

• Đối tượng: 1570 noãn GV từ 490 người hiến tặng trẻ (18-35 tuổi, đủ tiêu chuẩn về sức khỏe và dự trữ buồng trứng) đã trải qua quá trình kích thích buồng trứng và thu nhận noãn.

• Phương pháp: Noãn GV được nuôi cấy ngẫu nhiên trong 11 môi trường nuôi cấy thương mại khác nhau (Môi trường A-K, bao gồm các môi trường của hệ thống MediCult IVM, môi trường Sydney IVF, G-2 PLUS, CSCM, GLOBAL TOTAL, GEMS, CSCM-NXC) trong tủ ấm (Embryoscope, 37°C, 6% CO2, 5% O2) trong 24 giờ.

• Mục tiêu: Đánh giá tỷ lệ rIVM (tỷ lệ GV tiến triển thành MII trong 24 giờ) và động học nhân (thời gian phá vỡ túi mầm - tGVBD, và thời gian xuất hiện thể cực đầu tiên - t1PB) theo từng loại môi trường.

• Lựa chọn: Hai môi trường có tỷ lệ rescue cao nhất trong thời gian nuôi cấy ngắn nhất sẽ được chọn cho giai đoạn tiếp theo.

Giai đoạn 2: Đánh giá khả năng tế bào chất ban đầu của R-MII (190 noãn GV bổ sung)

• Đối tượng: 190 noãn GV bổ sung được phân bổ ngẫu nhiên vào hai môi trường tốt nhất đã chọn từ Giai đoạn 1. Chỉ những noãn r-MII trưởng thành trong vòng 24 giờ được đưa vào đánh giá.

• Phương pháp: Noãn r-MII trải qua hoạt hoá noãn nhân tạo (artificial oocyte activation - AOA) bằng cách ủ trong A23187 và puromycin. Sau đó, được nuôi cấy, theo dõi và được đánh giá sau 16-20 giờ.

• Mục tiêu: So sánh tỷ lệ hoạt hoá noãn bình thường (Normal oocyte activation rates - NOAR) (tỷ lệ r-MII tạo thể cực thứ hai và một nhân tiền nhân duy nhất) và động học hình thái chu kỳ tế bào đầu tiên (thời gian xuất hiện/mờ dần nhân tiền nhân - tPNa/tPNf, và thời gian pha S).

Đặc điểm người hiến tặng và phác đồ kích thích buồng trứng

• Người hiến tặng: Phụ nữ 18-35 tuổi, chu kỳ kinh nguyệt đều, không có bệnh di truyền/bất thường nhiễm sắc thể, BMI 18-28 kg/m², dự trữ buồng trứng bình thường (AMH > 1,5 ng/ml hoặc AFC > 12). Việc sử dụng noãn GV từ người hiến tặng loại bỏ các yếu tố vô sinh liên quan đến mẹ.

• Kích thích buồng trứng: Sử dụng rFSH hoặc hMG kết hợp với medroxyprogesterone acetate (MPA) hàng ngày. Kích thích phóng noãn bằng triptorelin khi có ≥3 nang noãn ≥18 mm. Chọc hút noãn tại thời điểm 36 giờ sau kích hoạt phóng noãn.

Thu thập noãn và quy trình rIVM-GV
Sau khi chọc hút, COC được thu thập, ủ 2 giờ rồi loại bỏ cumulus bằng hyaluronidase. Noãn không có cumulus được phân loại là MII hoặc chưa trưởng thành (MI hoặc GV). Noãn GV được xác định và phân bổ ngẫu nhiên (tối đa 4 noãn GV/người hiến) vào các môi trường nuôi cấy. Noãn GV được nuôi cấy riêng lẻ trong 25 µl môi trường và được theo dõi bằng Embryoscope.
Phân tích Thống kê

• Biến phân loại: Thể hiện bằng số ca (N) và tỷ lệ (%) với 95% CI, so sánh bằng kiểm định chính xác của Fisher.

• Biến liên tục: Thể hiện bằng trung bình ± SD, kiểm tra chuẩn bằng Kolmogorov–Smirnov, phân tích bằng ANOVA. Giai đoạn II sử dụng kiểm định t cho mẫu độc lập.

• Ý nghĩa thống kê: P<0,05. Phân tích công suất sau thử nghiệm bằng G*Power.

KẾT QUẢ
Nghiên cứu bao gồm 1760 noãn GV từ 490 người hiến tặng trẻ tuổi. Trung bình, mỗi người hiến tặng thu được 21,2 ± 9,2 noãn, với tỷ lệ trưởng thành MII ban đầu là 80,1%. 3,2 ± 0,5 noãn GV được xác định trên mỗi người hiến.
Giai đoạn 1: Đánh giá tỷ lệ cứu hộ và động học trưởng thành (1570 noãn GV)
Tổng cộng 47% (738/1570) noãn GV trưởng thành thành MII trong vòng 24 giờ nuôi cấy.

• Tỷ lệ rescue: Các môi trường F, G, J và K cho tỷ lệ rescue cao nhất (>50%), vượt trội đáng kể so với các môi trường khác (D, I ~46%; H ~40%; A, C ~35-36%; B, E <30%).

• Động học trưởng thành: Noãn GV nuôi cấy trong môi trường G và K đạt giai đoạn MII sớm nhất (trung bình 19,4 ± 0,2 giờ; P=0,001) so với các môi trường còn lại. Sự khác biệt này chủ yếu do thời gian duy trì ở giai đoạn GV hoặc MI kéo dài hơn trong các môi trường khác.

Giai đoạn 2: Khả năng tế bào chất sau AOA (190 noãn GV)
Dựa trên kết quả Giai đoạn 1, môi trường G và K được chọn để so sánh khả năng tế bào chất ban đầu của noãn r-MII sau AOA, vì chúng cho tỷ lệ rescue cao nhất trong thời gian ngắn nhất (trung bình 55,3%).

• Tỷ lệ rescue: Mức độ rescue được xác nhận tương đương giữa môi trường G (53,6%) và K (57%) (P=0,7).

• Phản ứng AOA: Noãn r-MII từ môi trường K (n=53) cho thấy tỷ lệ hoạt hóa và tỷ lệ hoạt hóa noãn bình thường (NOAR) cao hơn đáng kể (lần lượt 82,2% và 69,9%) so với môi trường G (n=52; lần lượt 59,4% và 40,6%).

• Động học chu kỳ tế bào đầu tiên: Mặc dù tỷ lệ hoạt hóa khác biệt, động học hình thái của các thể sinh sản đơn tính (tPNa, tPNf, chiều dài pha S) tương đương nhau giữa hai môi trường G và K (không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.

Tóm lại, môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ và động học trưởng thành của noãn GV trong rIVM, cũng như khả năng hoạt hóa tế bào chất sau đó. Môi trường K cho thấy tiềm năng vượt trội trong việc tối ưu hóa tỷ lệ hoạt hóa noãn sau rIVM.
KẾT LUẬN
Nghiên cứu này chỉ ra rằng để rIVM thành công, sự trưởng thành của nhân và tế bào chất phải diễn ra đồng bộ. Cần nghiên cứu sâu hơn để hiểu rõ cơ chế sinh học và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy cho noãn GV rIVM. Dữ liệu gợi ý rằng việc sử dụng glucose làm nguồn năng lượng chính có thể làm giảm hiệu quả IVM. Ngược lại, các môi trường dựa trên lactate/pyruvate (L/P) thấp có thể tạo điều kiện thuận lợi hơn cho nhân và tế bào chất của noãn rGV từ phụ nữ trẻ có tiên lượng tốt.
Mặc dù nhóm nghiên cứu tập trung vào thành phần định tính của pyruvate và lactate, cần có phân tích định lượng chi tiết hơn. Ngoài ra, các yếu tố khác trong môi trường như axit amin, độ thẩm thấu, độ pH, hormone hoặc các chất phụ gia sinh học có thể đóng vai trò quan trọng trong hiệu quả của rIVM.
Tóm lại, nghiên cứu này đã sử dụng các môi trường thương mại dành cho nuôi cấy phôi để đánh giá sự phù hợp trong rIVM-GV. Do các công ty không tiết lộ đầy đủ công thức môi trường, các nghiên cứu tương lai cần tập trung vào việc làm sáng tỏ cơ chế sinh lý đằng sau hiệu quả rIVM. Đồng thời, cần mở rộng nghiên cứu sang nhóm bệnh nhân có tiên lượng kém hoặc lớn tuổi, bao gồm cả noãn MI, và theo dõi toàn diện khả năng phát triển, tính toàn vẹn nhiễm sắc thể và tiềm năng sinh sản của noãn r-MII để đảm bảo an toàn cho việc ứng dụng lâm sàng rộng rãi.

Tài liệu tham khảo: Soler, N., Cimadomo, D., Escrich, L., Grau, N., Galán, A., Alamá, P., ... & Escribá, M. J. (2025). Rescue in vitro maturation of germinal vesicle oocytes after ovarian stimulation: the importance of the culture media. Human Reproduction, deaf099.