CNSH. Lê Thị Quỳnh – IVFMD SIH – Bệnh viện Phụ sản Quốc tế Sài Gòn
 
TỔNG QUAN
Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization – WHO) định nghĩa vô sinh là tình trạng các cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh sản không thể thụ thai trong vòng 1 năm quan hệ tình dục thường xuyên không có biện pháp bảo vệ. Khoảng 7% nam giới và ∼12% phụ nữ trên toàn thế giới gặp vấn đề về sinh sản, trong đó yếu tố nam gây ra ∼20–30% trong số tất cả các trường hợp vô sinh.
 
Nguyên nhân dẫn đến vô sinh nam có nhiều yếu tố: di truyền, bất thường nhiễm sắc thể (NST), đột biến thượng di truyền, bất thường nội tiết tố, nhiễm trùng hoặc bất thường đường sinh sản. Kiểu hình vô sinh nam chủ yếu dẫn đến các thông số tinh dịch bất thường như mật độ tinh trùng thấp, dị dạng và khả năng di động giảm.
 
Tiêu chuẩn xét nghiệm di truyền vô sinh nam dựa trên sàng lọc NST để tìm các bất thường về cấu trúc và số lượng, sau đó phân tích mất đoạn ở vùng AZF (yếu tố vô tinh - azoospermia factor) của NST Y. Trong những năm gần đây, với sự phát triển của công nghệ NGS, gồm giải trình tự bộ gen DNA và RNA, và các mô hình động vật vô sinh (mô hình chuột) với hơn 860 gen được đánh giá đã bắt đầu kỷ nguyên khám phá mới về vô sinh nam trên quy mô lớn.
Nghiên cứu này xác định vai trò của gen Tcte1 trong vô sinh nam bằng cách sử dụng mô hình chuột về quá trình bất hoạt gen. Protein Tcte1 là yếu tố cấu trúc xây dựng N-DRC, một phức hợp trong sợi trục tinh trùng chịu trách nhiệm điều phối các hoạt động của đuôi liên quan đến chuyển động của tinh trùng. Một trong những gen cấu trúc N-DRC là TCTE1 (T-Complex-associated-Testis-Expressed 1), còn được gọi là DRC5, FAP155 và D6S46 ở người  hoặc Tcte1, D17S, Tcte-1 và D17Sil1 ở chuột. TCTE1 được bảo tồn tiến hóa ở hầu hết các sinh vật nhân chuẩn có lông hoặc đuôi chuyển động và cần thiết cho hoạt động bình thường của đuôi. Biểu hiện của TCTE1 được quan sát thấy cao nhất ở tinh hoàn.
 
Nhóm tác giả phát hiện các đột biến trong mô hình gen Tcte1 bị bất hoạt ở chuột biểu hiện hai kiểu hình, phụ thuộc vào số lượng alen bị ảnh hưởng: nam giới đồng hợp tử vô sinh (có hai alen bị bất hoạt) mắc chứng oligoasthenoteratozoospermia (giảm số lượng, khả năng di động và hình dạng kém) và nam giới dị hợp tử có khả năng sinh sản (có một alen bị bất hoạt) mắc chứng oligozoospermia (chỉ giảm số lượng tinh trùng). Nhóm nghiên cứu đã tạo ra những con chuột đồng hợp tử và dị hợp tử, sau đó kiểm tra tiềm năng sinh sản, sự khác biệt về giải phẫu và mô học, và các thông số tinh dịch.
 
Các mẫu tinh trùng người có mật độ giảm nghiêm trọng đã được sàng lọc các biến thể TCTE1, tiếp theo là mô hình dự đoán protein của các biến thể được phát hiện. Do đó, nghiên cứu này chứa dữ liệu mới và toàn diện liên quan đến vai trò của TCTE1 trong vô sinh nam vì vai trò quan trọng trong quá trình sinh tinh, ảnh hưởng đến nhiều mạng lưới phân tử của tinh hoàn (bao gồm cả quá trình xử lý năng lượng) và chức năng bình thường của tinh trùng.
 
THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU
Kỹ thuật chỉnh sửa bộ gen CRISPR/Cas9 được sử dụng, dòng đột biến gen Tcte1 dị hợp tử ở chuột ( Tcte1^+/- ) đã được tạo ra trên cơ sở chủng C57Bl/6J.
 
Chuột Tcte1^+/- trưởng thành được giao phối để tạo ra chuột Tcte1^-/- đồng hợp tử. Chuột Tcte1^+/+ (WT) sử dụng làm nhóm chứng. Tất cả chuột được nuôi trong môi trường không có mầm bệnh với đầy đủ thức ăn và nước uống, nhiệt độ ổn định là 22°C và chu kỳ sáng - tối là 12:12 giờ.
 
Tiềm năng sinh sản của chuột, các thông số tinh dịch, mức độ biểu hiện gen tinh hoàn, ATP của tinh trùng và các phép đo mức độ apoptosis tinh hoàn đã được đánh giá. Tiếp theo là hình ảnh hóa các protein N-DRC trong tinh trùng và mô hình hóa protein trong silico.
 
Một nghiên cứu giải trình tự bộ gen thí điểm của các mẫu từ nam giới vô sinh ở người (n = 248) đã được áp dụng để sàng lọc các biến thể TCTE1 .
 
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Để kiểm tra tiềm năng sinh sản, chuột trưởng thành được lai tạo để sinh ba lứa trên mỗi cặp nhốt không quá 6 tháng, theo nhiều tổ hợp hợp tử khác nhau. Tất cả các thí nghiệm được thực hiện đối với chuột đực WT (Tec1^+/+), Tcte1^+/- và Tcte1^-/-.
 
Giải phẫu tổng thể được thực hiện trên các mẫu tinh hoàn và mào tinh hoàn, sau đó phân tích tinh dịch và giải trình tự RNA (RNAseq; Illumina). Tương tác STRING được kiểm tra để tìm tương tác protein-protein, dựa trên mức độ biểu hiện thay đổi của các gen trong các thí nghiệm RNAseq tinh hoàn chuột. Nhuộm miễn dịch huỳnh quang tại chỗ được thực hiện để phát hiện các protein phức hợp N-DRC trong tinh trùng chuột và mức độ apoptosis thông qua hình ảnh caspase 3 trên các mẫu tinh hoàn chuột.
 
Để xác định lượng ATP trong tinh trùng, tiến hành đo mức độ phát quang. DNA từ các mẫu máu của chuột đực vô sinh được chiết xuất để thực hiện giải trình tự bộ gen (WGS, WES hoặc Sanger). Mô hình dự đoán protein của các biến thể được xác định ở người và cấu trúc exon 3 bị mất trong quá trình loại bỏ gen ở chuột cũng được thực hiện.
 
KẾT QUẢ
Về tiềm năng sinh sản: Những cặp lai nhốt có chuột đực Tcte1^-/- không có con (Tcte1^-/- × WT). Các tổ hợp khác (Tcte1^+/-  x  Tcte1^+/- ; Tcte1^+/- × WT) cho kết quả tương tự khi xem xét số lứa, số con và tỷ lệ giới tính. Từ kết quả cho thấy chuột đực đồng hợp tử mắc chứng oligoasthenoteratozoospermia bị vô sinh, trong khi chuột dị hợp tử biểu hiện chứng oligozoospermia vẫn có khả năng sinh sản.
 
Đánh giá mô học các lát cắt tinh hoàn và mào tinh hoàn cho thấy không có sự khác biệt về cấu trúc giữa chuột đực WT, Tcte1^+/- và Tcte1^-/-, xác nhận quá trình sinh tinh được bảo tồn. Không có sự khác biệt về trọng lượng cơ thể và chiều dài mào tinh hoàn. Khi xem xét các thông số tinh dịch, ở chuột đực Tcte1^-/- và Tcte1^+/-, mật độ tinh trùng giảm đáng kể khi so sánh với kết quả đối chứng (P  < 0,0001).
 
Giải trình tự RNA của mô tinh hoàn cho thấy đột biến Tcte1 ảnh hưởng đến kiểu biểu hiện của 21 gen chịu trách nhiệm xử lý ATP ty thể hoặc liên quan đến apoptosis hoặc sinh tinh. Ở chuột đực Tcte1^-/-, mức độ biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình ly giải tinh dịch và phân hủy protein chất nền ngoại bào ở vùng xung quanh tế bào Leydig của tinh hoàn chuột trưởng thành (Klk1b27, Klk1b21, Klk1b24) hoặc hoạt động của tế bào thần kinh (Klk1b22) giảm 2-8 lần so với chuột đực Tcte1^+/- và WT.
 
Nhuộm miễn dịch huỳnh quang tại chỗ được sử dụng để phát hiện protein N-DRC. Tinh trùng chuột WT và Tcte1^+/- có sự hiện diện của protein Tcte1 trong nhân đầu tinh trùng, cổ và một phần đuôi. Ở chuột đực Tcte1^-/- tín hiệu huỳnh quang chỉ tập trung ở nhân. Điều này biểu hiện protein Tcte1 không được sản xuất đúng cách, chỉ có một lượng sót lại trong nhân đầu tinh trùng, không có sự vận chuyển đến đuôi tinh trùng. Các tín hiệu dương tính với Casp3 (dấu hiệu apoptosis) chỉ được quan sát thấy ở tinh nguyên bào, tương tự ở cả ba kiểu gen.
 
Việc sàng lọc đột biến ở nam giới vô sinh đã phát hiện ra một biến thể dị hợp mới và năm biến thể cực hiếm (được dự đoán là gây bệnh) ở 6,05% bệnh nhân được nghiên cứu. Mô hình dự đoán protein của các biến thể được xác định đã phát hiện những thay đổi trong điện thế bề mặt protein, cho thấy sự tương tác bị gián đoạn của TCTE1 với các liên kết nằm trong sợi trục.
 
KẾT LUẬN
Nghiên cứu chứa dữ liệu mới và xác định vai trò quan trọng của TCTE1 trong quá trình sinh tinh và hoạt động bình thường của tinh trùng. Các đột biến trong mô hình loại bỏ gen Tcte1 ở chuột cho thấy hai kiểu hình, chuột đồng hợp tử oligoasthenoteratozoospermic vô sinh và chuột dị hợp tử oligozoospermic có khả năng sinh sản, cho thấy sự liên quan của cơ chế đơn bội. Protein Tcte1 hoạt động trong quá trình sinh tinh và các đột biến làm tăng mức độ biểu hiện lâm sàng của các thông số tinh dịch giảm. Cần có nhiều nghiên cứu chuyên sâu hơn để làm rõ các cơ chế chịu trách nhiệm cho các con đường phân tử của tương tác giữa Tcte1 (protein cấu trúc) và các liên kết khác có mức độ biểu hiện thay đổi đáng kể trong nghiên cứu này.
 
Tài liệu tham khảo: Marta Olszewska et al (2024) Effects of Tcte1 knockout on energy chain transportation and spermatogenesis: implications for male infertility, Human Reproduction Open, Volume 2024.

Từ khóa: TCTE1, N-DRC, vô sinh nam, oligoasthenoteratozoospermia, khả năng di chuyển của tinh trùng, ty thể tinh trùng, mt-Co2, Fetub, thiếu hụt đơn bội, MMAF.