Chu Khánh Linh, Nguyễn Hữu Duy – IVFMD Vạn Hạnh
 
Năm 2013, Hiệp hội Y học Sinh sản Hoa Kỳ đã chấp nhận “đông lạnh noãn trưởng thành ở người” là một công nghệ được sử dụng rộng rãi [1]. Phạm vi ứng dụng lâm sàng của đông lạnh noãn dần được mở rộng, bao gồm bảo tồn khả năng sinh sản trước xạ trị-hoá trị, điều trị thụ tinh ống nghiệm cho trường hợp không lấy được tinh trùng vào ngày chọc hút noãn, hiến noãn và bảo tồn khả năng sinh sản của phụ nữ không vì lý do y tế.
 
Mặc dù đông lạnh noãn được xem là một kỹ thuật đang phát triển, với số lượng trẻ sinh sống ngày càng tăng nhưng các tác động từ góc độ di truyền biểu sinh vẫn phải nghiên cứu sâu hơn. Di truyền biểu sinh (Epigenetics) đề cập các quá trình thay đổi di truyền về chức năng gen và kiểu hình mà không sửa đổi trình tự nucleotide, chủ yếu, bao gồm quá trình methyl hóa DNA, sửa đổi histone và điều hòa RNA không mã hóa, có thể ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến trạng thái của nhiễm sắc thể (NST) để kích hoạt hoặc kìm hãm biểu hiện gen [2].
 
Di truyền biểu sinh có thể bị tác động bởi môi trường xung quanh, do đó noãn khi trải qua quá trình đông lạnh sẽ có những sự thay đổi như thế nào và liệu có ảnh hưởng đến tiềm năng phát triển phôi hay không.
 

1. Methyl hoá DNA

Methyl hóa DNA là quá trình di truyền biểu sinh được nghiên cứu nhiều nhất, liên quan đến việc bổ sung một nhóm methyl ở vị trí carbon 5 của vòng cytosine (5mC) trong dinucleotide cytosine-guanine (CpG) bởi DNA methyltransferase (DNMTs) [3]. Quá trình methyl hóa DNA thường tương quan với quá trình làm im lặng gen, nhưng nó cũng liên quan đến các cơ chế điều hòa khác như in vết gen hay bất hoạt nhiễm sắc thể X và làm im lặng các trình tự tâm động.
 
Động vật có vú trải qua hai đợt khử methyl hoá và tái methyl hoá toàn bộ DNA trong quá trình di truyền sự sống giữa các thế hệ. Đợt khử DNA đầu tiên xảy ra trong tế bào mầm (PGCs- primordial germ cells), là tổ tiên của noãn và tinh trùng, tại đây các gen trong tế bào soma của bố và mẹ bị xóa. Sau đó, quá trình methyl hóa DNA đã được thiết lập lại trong quá trình sinh tinh và sinh noãn. Đợt thứ hai xảy ra ở giai đoạn thụ tinh và tạo phôi sớm. Bộ gen của bố mẹ trải qua một đợt khử và tái methyl hoá DNA để tái lập trình di truyền biểu sinh. Lần tái lập trình này có vai trò đối với sự phát triển phôi sớm và quá trình phát triển cơ thể sau đó [4, 5].
 
Hầu hết các nghiên cứu về ảnh hưởng mức độ methyl hóa DNA được thực hiện ở động vật. Mức độ methyl hoá DNA ở noãn bò sau khi rã đông đã giảm [6]. Trong khi đó, ở noãn chuột, quá trình đông lạnh giảm đáng kể mức độ methyl hóa trong vùng khởi động của gen Oct4 và Sox2, ngoài ra còn làm giảm mức độ của các gen in dấu H19, Peg3 và Snrpn trong phôi nang. Nhưng không làm thay đổi đáng kể mức độ methyl hóa của các đảo CpG trong các vùng tăng cường của Dnmt1o, Hat1 và Hdac1 [7].
 
Hiện chỉ có 3 nghiên cứu thực hiện về quá trình methyl hóa DNA của quá trình đông lạnh noãn ở người. Vào năm 2015, một nghiên cứu đã phân tích mức độ methyl hóa ở phôi ngày 3 bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang của 5mC, cho thấy không có sự khác biệt đáng kể trong quá trình methyl hóa DNA giữa phôi có nguồn gốc từ noãn hiến tặng và noãn tươi [8]. Hai nghiên cứu khác đã phân tích rằng ở giai đoạn noãn GV khi trưởng thành trong ống nghiệm không bị tác động đáng kể ở mức độ methyl hoá DNA [9, 10].
 
Tóm lại, các nghiên cứu hiện tại vẫn chưa có sự đồng nhất kết quả mức độ methyl hoá DNA khi đông lạnh noãn, phôi sớm ở người và động vật. Hơn nữa, chưa rõ liệu sự methyl hoá có khác nhau giữa các loài hay không, trong khi các nghiên cứu còn hạn chế số lượng và phương pháp phân tích. Do đó, trong tương lai cần nhiều nghiên cứu thực nghiệm hơn để phân tích quá trình methyl hoá DNA ở noãn sau rã đông.
 

2. Biến đổi histone  

Histone là thành phần chính của nucleosome, đơn vị cấu trúc của chất nhiễm sắc. Nucleosome bao gồm 1 đoạn DNA quấn quanh một lõi phức hợp có 8 phân tử histone (2 bản sao mỗi loại: H2A, H2B, H3 và H4) gọi là octamer. Đầu tận cùng N tự do của histone có thể trải qua nhiều biến đổi khác nhau, bao gồm acetyl hóa, methyl hóa, phosphoryl hóa, ribosyl hóa ADP,... nhằm kiểm soát trạng thái của NST để kích hoạt hoặc ức chế phiên mã [4, 5].
 
Sửa đổi histone thường đi kèm với quá trình methyl hóa DNA để đóng hay mở gen. Về cơ bản, quá trình methyl hóa DNA ở vùng khởi động có liên quan đến sự ức chế phiên mã, trong khi quá trình acetyl hóa histone có liên quan đến hoạt hóa phiên mã. Trên thực tế, khi DNA bị methyl hóa, lysine 9 của histone H3 bị khử methyl hoặc trimethylated (H3K9me2/me3), NST bị nén và quá trình phiên mã bị chặn. Ngược lại, khi DNA bị khử methyl, lysine 9 của histone H3 bị acetyl hóa, lysine 4 của histone H3 bị khử methyl hoặc trimethylated (H3K4me2/ME3), NST được nới lỏng và quá trình phiên mã được hoạt hoá [5].
 
Giống như quá trình methyl hóa DNA, sửa đổi histone sau dịch mã rất quan trọng trong quá trình sinh noãn và phát triển phôi tiền làm tổ. Ví dụ, trong noãn chuột ở giai đoạn phát triển thành MII, H3K4me3 xuất hiện dưới dạng đặc trưng tại các vùng tăng cường, và sau đó trong giai đoạn sau, H3K4me3 biến thể (ncH3K4me3) dần dần thay thế H3K4me3. Lúc này, bộ gen noãn MII chuyển sang trạng thái im lặng. Tiếp đó, H3K4me3 xuất hiện lại và loại bỏ biến thể ncH3K4me3 ở giai đoạn phôi 2 tế bào. Điều này được cho là cần thiết cho sự kích hoạt bộ gen hợp tử và sự phát triển của phôi [4, 5]. Ngoài ra, H3K27me3 đã được chứng minh là được di truyền từ bộ gen mẹ trong quá trình tạo phôi sớm, liên quan đến việc điều chỉnh việc kích hoạt vùng tăng cường và vùng gen đặc trưng của loài [2, 5].
 
Nghiên cứu đã chỉ ra rằng quá trình đông lạnh có thể làm giảm đáng kể mức độ H3K9me3, nhưng tăng mức độ acetyl hóa H3K9 của noãn và phôi phân chia ở bò [6]. Bên cạnh đó, ở lợn và chuột, quá trình acetyl hóa histone H4 trong noãn tăng đáng kể sau đông lạnh [4, 5, 11].
 
Nhìn chung, các nghiên cứu biến đổi histone chỉ mới được thực hiện trên động vật và kết quả thu được chưa nhất quán vì thực hiện trên các sửa đổi histone khác nhau. Tuy nhiên, dường như quá trình đông lạnh noãn có ảnh hưởng đến sự biến đổi histone.
 

3. Sự biến đổi RNA không mã hoá

Phần lớn các gen ở người có thể được phiên mã thành RNA, nhưng chỉ có khoảng 2% bộ gen mã hóa protein. RNA không có tiềm năng mã hóa protein được gọi là RNA không mã hóa (ncRNA – non-coding RNA) và hầu hết RNA là ncRNA. Theo số lượng nucleotide, ncRNA có thể được chia thành RNA nhỏ (ncRNA nhỏ, ít hơn 200 nucleotide) và RNA dài không mã hóa (lncRNA – long non-coding RNA, hơn 200 nucleotide), và cũng có RNA vòng (circRNA – circular RNA) [12].
 
Ở động vật có vú, lncRNA tham gia vào quá trình điều hòa phiên mã, điều này liên quan đến tính đa năng và sự biệt hóa của tế bào. Ví dụ, Xist lncRNA và trình tự đối nghĩa Tsix của nó liên quan đến quá trình bất hoạt nhiễm sắc thể X. Ngoài ra, các ncRNA nhỏ là một nhóm các chất điều chỉnh sau phiên mã quan trọng, chủ yếu chứa các microRNA (miRNA), RNA can thiệp nhỏ nội sinh (endo-siRNA) và RNA tương tác Piwi (piRNA). Các miRNA có thể tương tác với vùng 3′ chưa được dịch mã của mRNA mục tiêu để phân hủy mRNA và ức chế biểu hiện gen. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự biểu hiện bất thường của miRNA trong tế bào mầm sinh dục cái và phôi có liên quan đến vô sinh, khiếm khuyết trong quá trình tạo phôi. Bên cạnh đó, endo-siRNA được cho là rất quan trọng đối với sự giảm phân ở noãn khi chúng liên quan đến thoi vô sắc và sự phân chia NST. Còn piRNA liên quan đến sự kiểm soát retrotransposon (nhân số chuyển vị ngược) trong noãn [4, 5].
 
Các RNA không mã hóa rất nhạy cảm với môi trường nên có thể bị tác động bởi quá trình đông lạnh. Vào năm 2019, một nghiên cứu về so sánh miRNA trong noãn tươi và đông lạnh ở chuột đã phát hiện ra rằng 22 miRNA được biểu hiện khác nhau giữa hai nhóm và hầu hết các gen mục tiêu được điều chỉnh bởi các miRNA đều có liên quan chặt chẽ với quá trình trao đổi chất. Kết quả giải trình tự cho thấy số lượng Mir-134-5p, Mir-210-5p và Mir-21-3p tăng đáng kể trong noãn đông lạnh, trong khi Mir-465C-5p lại giảm đáng kể [13]. Ngoài ra, với vai trò là chất điều hòa âm của con đường truyền tín hiệu PI3K/AKT, PTEN đóng vai trò quan trọng trong việc phối hợp hoạt hóa nang noãn nguyên thủy và sửa chữa tổn thương DNA của noãn. Tuy nhiên, sự biểu hiện của PTEN trong noãn đông lạnh đã giảm đáng kể ở cả cấp độ sau phiên mã [4]. Một nghiên cứu khác ở noãn người bằng RNA-seq cũng phát hiện ra sự giảm số lượng của một số lncRNA ở nhóm đông lạnh so với nhóm đối chứng [14].
 
Do đó, quá trình đông lạnh noãn có thể dẫn đến giảm biểu hiện của một số RNA không mã hóa cụ thể. Tuy nhiên, hiện nay số lượng nghiên cứu về lncRNA và các loại RNA mã hóa ngắn khác còn rất ít, nên chức năng của chúng vẫn chưa được khám phá đầy đủ.
 

4. Sự thay đổi biểu hiện gen ở noãn

Đông lạnh noãn ảnh hưởng đến sự biểu hiện gen vẫn đang nghiên cứu ở giai đoạn sơ bộ. Một nghiên cứu năm 2012, sử dụng phương pháp microarray để so sánh biểu hiện gen giữa noãn tươi và đông lạnh ở người, cho thấy sự khác biệt đáng kể trong biểu hiện gen giữa hai nhóm, đặc biệt là sự giảm số lượng của nhiều gen trong con đường ubiquitin [15]. Một nghiên cứu mới đây, sử dụng giải trình tự phiên mã, cũng phát hiện ra rằng quá trình đông lạnh làm giảm mức độ phiên mã của các gen liên quan đến sự hình thành và phát triển ở noãn; cũng như các quá trình sinh học: chu kỳ tế bào, giảm phân, trao đổi chất, methyl hóa DNA và sửa chữa tổn thương DNA. Trong đó HSPA1A và HSPA1B là những con đường tiêu biểu nhất. HSPA1A và HSPA1B có vai trò quan trọng trong điều hoà miễn dịch, chống lại sự apoptosis và liên quan đến khả năng phản ứng sốc nhiệt của noãn và phôi sớm. Từ đó, sự điều hòa giảm biểu hiện gen HSPA1A và HSPA1B, đi ngược lại quá trình tổng hợp protein làm giảm tiềm năng phát triển của noãn [16].
Ở động vật, từ các mô hình khác nhau, cũng phát hiện sự thay đổi biểu hiện gen sau đông lạnh noãn. Trong mô hình noãn bò và lợn, tìm thấy sự khác biệt giữa nhóm noãn đông lạnh và tươi, đặc biệt là các gen liên quan đến điều hòa phiên mã, phân chia và biệt hóa tế bào cũng như quá trình apoptosis. Ngược lại, ở chuột lại không tìm thấy sự khác biệt giữa noãn tươi và đông lạnh [4, 5]. Tóm lại, hầu hết các nghiên cứu cho rằng sự đông lạnh có thể dẫn đến sự giảm mức độ biểu hiện gen trong noãn ở động vật và người.
 

5. Các yếu tố ảnh hưởng khác

Hai phương pháp đông lạnh được sử dụng hiện nay là đông lạnh chậm và thuỷ tinh hoá. Cả hai quy trình này đều ảnh hưởng tiêu cực đến sự biểu hiện gen của noãn MII ở người. Cụ thể, đông lạnh chậm có liên quan đến quá trình giảm của các gen liên quan đến duy trì cấu trúc nhiễm sắc thể (KIF2C và KIF3A) và điều hòa chu kỳ tế bào (CHEK2 và CDKN1B) có thể dẫn đến giảm khả năng phát triển của noãn. Trong khi ởcác noãn thủy tinh hóa, nhiều gen của con đường ubiquitin cũng bị giảm số lượng, bao gồm các thành viên của họ peptidase đặc hiệu ubiquitin và các tiểu đơn vị của proteasome 26S [15]. Tuy nhiên, sự suy giảm này có thể ổn định hàm lượng protein của người mẹ, điều đó cần thiết cho sự phát triển của noãn. Do đó, tác động của quá trình thủy tinh hóa đối với sinh lý noãn ít hơn trong đông lạnh chậm.
 
Trong vài năm qua, một số nghiên cứu đã tìm thấy mối quan hệ giữa chất bảo quản đông lạnh và sự thay đổi di truyền biểu sinh. Phân tử được nghiên cứu nhiều nhất và được sử dụng rộng rãi nhất là DMSO (Dimethyl sulfoxide). Các nghiên cứu đã báo cáo rằng DMSO can thiệp vào hoạt động của enzyme methyltransferase DNMTs, dù cơ chế cụ thể vẫn chưa được biết rõ. Các nghiên cứu trên mô hình động vật cũng chỉ ra rằng sau quá trình đông lạnh, sự biểu hiện của gen in dấu Kcnq1ot1 ở noãn chuột đã giảm đáng kể. Đối với noãn bò trưởng thành, sự biểu hiện của các gen in dấu Peg10, Kcnq1ot1 và Xist trong phôi nang lại tăng lên một cách bất thường [17]. Ở người, một nghiên cứu về tác động của DMSO đối với quá trình methyl hóa DNA trong các vi mô tim đã phát hiện sự rối loạn điều hòa của các con đường methyl hóa DNA [18]. DNMT1 và DNMT3a, yếu tố chính để duy trì quá trình methyl hóa DNA, đã tăng, trong khi TET1 (ten-eleven translocations) đóng vai trò quan trọng trong quá trình khử methyl hoá DNA, lại giảm. [17]. Nhìn chung, DMSO có những tác động đến sự thay đổi di truyền biểu sinh ở noãn và phôi sớm.
 
Một số nghiên cứu cũng tìm hiểu về thời gian lưu trữ noãn trong nitơ. Cụ thể, nghiên cứu đã phân tích biểu hiện gen giữa các noãn sau ba và sáu năm bảo quản trong nitơ lỏng và không tìm thấy gen nào biểu hiện khác nhau [17]. Tuy nhiên, tỷ lệ sống giảm đối với phôi được lưu trữ lâu hơn sáu năm. Tương tự với tỷ lệ mang thai lâm sàng và tỷ lệ sinh sống giảm đáng kể ở phôi nang được lưu trữ trong hơn 6 năm so với nhóm được đông lạnh dưới 3 năm [19]. Tóm lại, ý nghĩa và kết quả lâm sàng việc thay đổi di truyền biểu sinh trong đông lạnh noãn và phôi vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn.
 

6. Kết luận

Trong 4 thập kỷ qua, thụ tinh ống nghiệm đã có sự tiến bộ vượt bậc, với tỷ lệ mang thai trung bình là 40%. Hiện tại, ước tính có khoảng 9 triệu trẻ em được ra đời bởi TTON, chiếm khoảng 5% tổng số ca sinh. Đồng thời, số lượng cá nhân đông lạnh noãn hoặc phôi cũng gia tăng với 309.475 ca chuyển phôi đông lạnh (FET) chỉ được thực hiện ở Châu Âu trong 2018. Bên cạnh đó, tỷ lệ sinh sống của noãn sau đông lạnh hơn 84%. Các nghiên cứu cũng cho thấy tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ phôi phân chia, phôi chất lượng cao và kết quả thai cũng không khác biệt giữa các nhóm noãn đông lạnh và noãn tươi (ESHRE 2020). Tuy nhiên, ở mức độ phân tử, sự thay đổi di truyền biểu sinh vẫn phải được theo dõi thêm.
 
Nhìn chung, quá trình đông lạnh làm giảm mức độ methyl hóa DNA noãn hoặc phôi ở mô hình động vật nhưng không có tác dụng đáng kể ở noãn người. Các biến đổi histone và các RNA không mã hoá dường như cũng bị ảnh hưởng bởi quá trình đông lạnh noãn. Tuy nhiên, các nghiên cứu hiện tại vẫn còn sơ khai với số lượng rất ít. Do đó, để có được bằng chứng thuyết phục, nên áp dụng các công nghệ mới để phân tích mức độ tinh vi hơn. Ngoài ra, cần xem xét kỹ hơn các tác động từ môi trường như loại và nồng độ chất làm lạnh, thời gian bảo quản lạnh,… từ đó có những nghiên cứu tổng quan về ảnh hưởng của đông lạnh đến sự thay đổi di truyền biểu sinh ở noãn và sự phát triển phôi.
 

7. Tài liệu tham khảo

1. Practice Committees of the American Society for Reproductive Medicine and the Society for Assisted Reproductive Technology. Mature oocyte cryopreservation: a guideline. Fertil Steril. 2013 Jan;99(1):37-43. doi: 10.1016/j.fertnstert.2012.09.028.
2. Xu R, Li C, Liu X, Gao S. Insights into epigenetic patterns in mammalian early embryos. Protein Cell. 2021 Jan;12(1):7-28. doi: 10.1007/s13238-020-00757-z.
3. Tomizawa S, Nowacka-Woszuk J, Kelsey G. DNA methylation establishment during oocyte growth: mechanisms and significance. Int J Dev Biol. 2012;56(10-12):867-75. doi: 10.1387/ijdb.120152gk.
4. Barberet, J., Barry, F., Choux, C. et al. What impact does oocyte vitrification have on epigenetics and gene expression?. Clin Epigenet 12, 121 (2020). doi.org/10.1186/s13148-020-00911-8
5. Liu, Yu-bing, Ju Chen, and Ri-Cheng Chian. "Beyond Survival Effects of Vitrification-Warming on Epigenetic Modification and Maternal Transcripts of Oocytes." Embryology Update. IntechOpen, 2022. DOI: 10.5772/intechopen.107073
6. Chen H, Zhang L, Deng T, Zou P, Wang Y, Quan F, Zhang Y. Effects of oocyte vitrification on epigenetic status in early bovine embryos. Theriogenology. 2016 Aug;86(3):868-78. doi: 10.1016/j.theriogenology.2016.03.008.
7. Zhao XM, Ren JJ, Du WH, Hao HS, Wang D, Qin T, Liu Y, Zhu HB. Effect of vitrification on promoter CpG island methylation patterns and expression levels of DNA methyltransferase 1o, histone acetyltransferase 1, and deacetylase 1 in metaphase II mouse oocytes. Fertil Steril. 2013 Jul;100(1):256-61. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.03.009.
8. De Munck N, Petrussa L, Verheyen G, Staessen C, Vandeskelde Y, Sterckx J, Bocken G, Jacobs K, Stoop D, De Rycke M, Van de Velde H. Chromosomal meiotic segregation, embryonic developmental kinetics and DNA (hydroxy)methylation analysis consolidate the safety of human oocyte vitrification. Mol Hum Reprod. 2015 Jun;21(6):535-44. doi: 10.1093/molehr/gav013. 
9. Liu MH, Zhou WH, Chu DP, Fu L, Sha W, Li Y. Ultrastructural Changes and Methylation of Human Oocytes Vitrified at the Germinal Vesicle Stage and Matured in vitro after Thawing. Gynecol Obstet Invest. 2017;82(3):252-261. doi: 10.1159/000448143. 
10. Al-Khtib M, Perret A, Khoueiry R, Ibala-Romdhane S, Blachère T, Greze C, Lornage J, Lefèvre A. Vitrification at the germinal vesicle stage does not affect the methylation profile of H19 and KCNQ1OT1 imprinting centers in human oocytes subsequently matured in vitro. Fertil Steril. 2011 May;95(6):1955-60. doi: 10.1016/j.fertnstert.2011.02.029.
11. Yan LY, Yan J, Qiao J, Zhao PL, Liu P. Effects of oocyte vitrification on histone modifications. Reprod Fertil Dev. 2010;22(6):920-5. doi: 10.1071/RD09312. PMID: 20591326.
12. Beermann J, Piccoli MT, Viereck J, Thum T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 2016 Oct;96(4):1297-325. doi: 10.1152/physrev.00041.2015.
13. Maidarti M, Anderson RA, Telfer EE. Crosstalk between PTEN/PI3K/Akt Signalling and DNA Damage in the Oocyte: Implications for Primordial Follicle Activation, Oocyte Quality and Ageing. Cells. 2020 Jan 14;9(1):200. doi: 10.3390/cells9010200. 
14. Huo Y, Yuan P, Qin Q, Yan Z, Yan L, Liu P, Li R, Yan J, Qiao J. Effects of vitrification and cryostorage duration on single-cell RNA-Seq profiling of vitrified-thawed human metaphase II oocytes. Front Med. 2021 Feb;15(1):144-154. doi: 10.1007/s11684-020-0792-7. 
15. Monzo C, Haouzi D, Roman K, Assou S, Dechaud H, Hamamah S. Slow freezing and vitrification differentially modify the gene expression profile of human metaphase II oocytes. Hum Reprod. 2012 Jul;27(7):2160-8. doi: 10.1093/humrep/des153. Epub 2012 May 15. 
16. Radons J. The human HSP70 family of chaperones: where do we stand? Cell Stress Chaperones. 2016 May;21(3):379-404. doi: 10.1007/s12192-016-0676-6. 
17. Sciorio, R.; Manna, C.; Fauque, P.; Rinaudo, P. Can Cryopreservation in Assisted Reproductive Technology (ART) Induce Epigenetic Changes to Gametes and Embryos? J. Clin. Med. 2023, 12, 4444. doi.org/10.3390/jcm12134444.
18. Verheijen, M., et al. "DMSO induces drastic changes in human cellular processes and epigenetic landscape in vitro." Scientific reports 9.1 (2019): 4641.
19. Yan, Yueyue, et al. "Pregnancy and neonatal outcomes after long-term vitrification of blastocysts among 6,900 patients after their last live birth." Fertility and Sterility 119.1 (2023).

Từ khóa: Sự thay đổi di truyền biểu sinh ở noãn trải qua đông lạnh