CVPH. Lê Thị Bích Phượng - IVFMD Phú Nhuận

Hiện nay, thuật ngữ thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) đã không còn quá xa lạ. Tỉ lệ các cặp vợ chồng trong và sau độ tuổi sinh sản thực hiện kỹ thuật này ngày càng nhiều. Trong các trường hợp điều trị IVF, vô sinh nam chiếm khoảng 40-50% nguyên nhân gây vô sinh. Tinh dịch đồ là xét nghiệm đầu tay đánh giá khả năng sinh sản của nam giới tuy nhiên xét nghiệm này chỉ cho biết được một số thông số như mật độ, độ di động, tỉ lệ sống chết, hình dạng tinh trùng [1]… mà không đánh giá được tính toàn vẹn DNA của tinh trùng. Một số nghiên cứu cho thấy tính toàn vẹn DNA tinh trùng có vai trò quan trọng cho việc hình thành phôi, thai cũng như là trẻ sinh sống [2]. Vì vậy xác định được tính toàn vẹn DNA tinh trùng phần nào đánh giá chính xác hơn về khả năng sinh sản của nam giới cũng như xác định phương pháp điều trị thích hợp cho bệnh nhân.



Định nghĩa phân mảnh DNA tinh trùng
Phân mảnh DNA tinh trùng là tình trạng tổn thương cấu trúc di truyền của tinh trùng, cụ thể là sự đứt gãy bên trong DNA [3]. Sự phân mảnh có ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của nam giới cũng như kết quả điều trị thụ tinh trong ống nghiệm. DNA tinh trùng có thể bị phân mảnh trong suốt quá trình sản sinh tinh trùng, khi tiếp xúc với môi trường độc hại hoặc thực hiện xạ trị hay hoá trị liệu. Có khoảng 30% nam giới vô sinh có các chỉ số tinh dịch bình thường nhưng chỉ số phân mảnh DNA tinh trùng vượt ngưỡng [4].

Một số kỹ thuật xét nghiệm đánh giá phân mảnh DNA tinh trùng phổ biến
Xét nghiệm đánh giá phân mảnh DNA tinh trùng (SDF- Sperm DNA fragmentation) là kỹ thuật dùng để đo lường đứt gãy DNA trong tinh trùng. Các xét nghiệm này được xây dựng qui trình và phát triển với hy vọng giúp chẩn đoán vô sinh nam, dự đoán kết quả điều trị thụ tinh trong ống nghiệm. Hiện nay, có nhiều kỹ thuật đánh giá phân mảnh DNA tinh trùng, trong đó các phương pháp phổ biến bao gồm: Đánh dấu đứt gãy DNA bằng các dUTP (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling - TUNEL); Dịch chuyển từ điểm cắt (In situ nick translation-ISNT); Điện di tế bào đơn (Single cell gel electrophoresis - Comet); Khảo sát mức độ phân tán nhiễm sắc chất tinh trùng (Sperm chromatin dispersion – SCD); Khảo sát cấu trúc nhiễm sắc chất tinh trùng (Sperm chromatin structure assay- SCSA).

TUNEL
TUNEL là phương pháp đánh giá phân mảnh DNA tinh trùng trực tiếp thông qua dUTP (deoxyuridine triphosphate) gắn lên mạch đơn và mạch đôi của DNA đứt gãy bằng terminal deoxynucleotidyl transferase. Phân mảnh DNA được định lượng thông qua máy đếm dòng chảy tế bào (Flow cytometry- FCM) và phân tích định tính thông qua tín hiệu phát huỳnh quang hoặc kính hiển vi quang học. Xét nghiệm này có thể thực hiện trên một lượng nhỏ tinh trùng (<=200 tinh trùng), tinh trùng thu nhận từ tinh hoàn cũng có thể được đánh giá phân mảnh bằng kỹ thuật này. TUNEL có những ưu điểm về độ nhạy và chi phí, nhưng vẫn tồn tại những khuyết điểm về thời gian, ngưỡng giá trị cũng như hạn chế về đánh giá những tế bào tinh trùng chưa trưởng thành [5].

ISNT
ISNT là một dạng biến thể của kỹ thuật TUNEL dựa trên nguyên lý định lượng sinh học dUTP gắn vào DNA mạch đơn thông qua DNA polymerase. Một số nghiên cứu cho thấy mạch DNA đơn đứt gãy có thể được sửa chữa bởi phôi cao hơn mạch DNA đôi đứt gãy và mối liên quan giữa đứt gãy DNA mạch đơn trong thụ tinh invitro không được chứng minh. Vì kỹ thuật này chỉ dùng để đánh giá đứt gãy mạch DNA đơn nên không có giá trị lâm sàng, ngoài ra kỹ thuật này cũng bị hạn chế so với những kỹ thuật khác về độ nhạy và độ chính xác [6].

Comet
Comet là xét nghiệm đơn giản và có độ nhạy cao, định tính phân mảnh DNA mạch đôi và mạch đơn dựa trên điện di. Hình ảnh DNA phân mảnh có hình dạng như sao chổi với phần đầu là những DNA nguyên vẹn và phần đuôi là những DNA sai hỏng. Lượng DNA sai hỏng càng cao thì phần đuôi điện di hình sao chổi càng sáng và càng dài. Kỹ thuật Alkaline Comet được dùng để phát hiện đứt gãy DNA mạch đơn và mạch đôi, trong khi kỹ thuật Neutral Comet chỉ có thể phát hiện đứt gãy DNA mạch đôi, hai kỹ thuật này chủ yếu khác biệt về dung dịch đệm được sử dụng là neutral và alkaline. Ngoài ra, kỹ thuật Alkaline Comet có thể sử dụng để đánh giá tất cả các loại tế bào.
Giá trị lâm sàng của kỹ thuật này trong việc đánh giá khả năng sinh sản của nam giới được nhiều nhóm tác giả chứng minh. Tuy nhiên, đây là kỹ thuật chưa có quy trình chuẩn hoá nên khó có thể so sánh kết quả nghiên cứu từ nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau. Ngoài ra, một nhược điểm khác của kỹ thuật này là không phân biệt được DNA sai hỏng do nguyên nhân ngoại sinh hay do thao tác xét nghiệm và mức độ sai hỏng DNA có thể bị đánh giá sai do sự sắp xếp lộn xộn của các sợi DNA. Một số nhóm tác giả khuyến nghị không nên sử dụng kỹ thuật này trong đánh giá lâm sàng vì phần đuôi vệt điện di có thể mất đi hoặc trong trường hợp nhỏ và khó hình dung [7].

SCD
SCD là kỹ thuật xét nghiệm dựa trên đặc điểm của quầng halo tạo thành từ protein nhân tinh trùng bị loại bỏ sau khi bị biến tính bằng acid. Nói cách khác, nhân tinh trùng với DNA sai hỏng nghiêm trọng sẽ cho quầng halo rất nhỏ hoặc không tạo thành quầng halo, trong khi tinh trùng với DNA ít sai hỏng hơn sẽ phân tán DNA vòng và hình thành quầng halo kích thước lớn. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp với bộ kit Halosperm có sẵn với đầy đủ nguyên liệu, hóa chất và quy trình, thiết bị đơn giản, nhưng cách đánh giá còn mang tính chủ quan [8].

SCSA
SCSA được xem như là “tiêu chuẩn vàng” trong việc đánh giá phân mảnh DNA tinh trùng và được sử dụng rộng rãi tại nhiều trung tâm TTTON trên thế giới. Phương pháp này thực hiện dựa trên sự phát huỳnh quang khác nhau của đoạn DNA bị đứt gãy và đoạn DNA nguyên vẹn với chất nhuộm chuyên dụng và được đo bằng máy đếm dòng chảy tế bào [9]. Đây là xét nghiệm đánh giá duy nhất có qui trình chuẩn hoá và ngưỡng giá trị chuẩn để tham khảo. Chất nhuộm chuyên dụng sử dụng trong phương pháp này là Acridine orange (AO), có khả năng phát màu khác nhau khi bám lên mạch đôi hay mạch đơn DNA. Dưới ánh sáng laser kích thích màu xanh dương có bước sóng 488nm của máy đếm dòng chảy tế bào, AO bám vào DNA mạch đôi sẽ phát huỳnh quang màu xanh lá cây có bước sóng 515-530nm và AO bám vào mạch đơn sẽ phát huỳnh quang màu đỏ có bước sóng 630nm. Như vậy ánh sáng huỳnh quang màu đỏ chính là dấu hiệu để nhận biết DNA phân mảnh. Chỉ số phân mảnh DNA tinh trùng (DFI) trong phương pháp này được xác định bằng tỷ số của tín hiệu huỳnh quang màu đỏ trên tổng số tín hiệu huỳnh quang xanh và đỏ, hay nói cách khác, DFI được tính dựa trên tỷ số của tinh trùng bị phân mảnh trên tổng số tinh trùng.
Theo xét nghiệm này, nam giới bình thường có DFI < 15% và lý tưởng nhất là <10%. Nam giới có DFI từ 15% đến 30% có mức độ phân mảnh DNA nhẹ và khả năng sinh sản kém trong khi nam giới có DFI >30% có mức độ phân mảnh DNA nặng và khả năng sinh sản rất thấp [10]. Dựa trên chỉ số phân mảnh DNA tinh trùng, bác sĩ sẽ định hướng được biện pháp hỗ trợ sinh sản thích hợp cho bệnh nhân. Phác đồ thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm dựa trên DFI được đo bằng kỹ thuật SCSA có thể được thực hiện như sau: DFI <25%: Thực hiện IUI hoặc IVF; DFI >= 25%: thực hiện ICSI [5].

Kết luận
Kỹ thuật đánh giá phân mảnh DNA tinh trùng được thực hiện ngày càng phổ biến. Mỗi kỹ thuật đều có ưu và nhược điểm riêng. Tuy hiện tại chỉ có kỹ thuật SCSA là được chuẩn hoá quy trình cũng như xây dựng ngưỡng giá trị tham khảo nhưng việc xác định chỉ số phân mảnh để đánh giá khả năng sinh sản của nam giới là điều cần thiết. Tuỳ thuộc vào đặc điểm, mục tiêu lâm sàng của bệnh nhân và chính sách tại từng trung tâm mà kỹ thuật xét nghiệm phân mảnh DNA tinh trùng được sử dụng là khác nhau. Việc đánh giá sự phân mảnh DNA tinh trùng cung cấp thêm thông tin dự đoán về khả năng thành công của các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản, giúp bác sĩ và bệnh nhân định hướng điều trị phù hợp. Lựa chọn tinh trùng khoẻ mạnh không sai hỏng DNA để giảm thiểu tác động xấu đến kết cục điều trị thụ tinh trong ống nghiệm là điều cần thiết. Vì vậy xây dựng, phát triển và ứng dụng các kỹ thuật đánh giá phân mảnh DNA tinh trùng vào thực hành lâm sàng giúp cung cấp thêm thông tin cho bác sỹ và tư vấn lộ trình điều trị phù hợp cho bệnh nhân.