CNSH. Phan Thị Thanh Loan - Bệnh viện đa khoa Mỹ Đức

 

  1. Giới thiệu

Thủy tinh hóa đã tạo ra bước tiến mang tính cách mạng trong lĩnh vực đông lạnh giao tử và phôi, thay thế phương pháp đông lạnh chậm nhờ tỷ lệ sống sau rã cao và hiệu quả lâm sàng vượt trội. Sự đổi mới này mở rộng đáng kể phạm vi ứng dụng trong công nghệ hỗ trợ sinh sản (Assisted Reproductive Technology - ART), từ đông lạnh noãn chủ động đến chuyển phôi trữ lạnh, đồng thời góp phần nâng cao tỷ lệ trẻ sinh sống tích lũy và thúc đẩy xu hướng chuyển đơn phôi an toàn. Sau những nền tảng quan trọng của thụ tinh trong ống nghiệm (In Vitro Fertilization - IVF) và tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (Intracytoplasmic Sperm Injection - ICSI), sự ra đời của thủy tinh hóa đã đưa kỹ thuật này trở thành tiêu chuẩn toàn cầu. Hiện nay, chuyển phôi trữ lạnh (Frozen Embryo Transfer - FET) chiếm gần 40% tổng số chu kỳ ART tại nhiều khu vực, phản ánh vai trò quan trọng của đông lạnh trong thực hành lâm sàng [1].

Dựa trên những thành tựu đã đạt được, các nghiên cứu hiện nay tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình thủy tinh hóa và rã đông nhằm nâng cao hiệu quả và tính an toàn. Hướng nghiên cứu chủ yếu là đơn giản hóa và rút ngắn bước cân bằng hoặc rã đông, qua đó giảm thời gian tiếp xúc với chất bảo vệ đông lạnh (Cryoprotectant Agent - CPA) và hạn chế các tác động bất lợi lên giao tử cũng như phôi. Mục tiêu của bài tổng quan là trình bày cơ sở khoa học, cập nhật bằng chứng thực nghiệm và đánh giá tiềm năng của phương pháp thủy tinh hóa cực nhanh (Ultra Fast Vitrification – UFV) và rã đông cực nhanh (Ultra Rapid Warming – URW).

  1.  Cơ sở lý thuyết của thủy tinh hóa noãn và phôi

Thủy tinh hóa phôi là kỹ thuật đông lạnh nhằm đưa phôi và môi trường đạt trạng thái “thủy tinh” (glass-like) mà không xảy ra sự hình thành tinh thể đá. Việc loại bỏ hoàn toàn quá trình tạo tinh thể đá nội bào và ngoại bào giúp tránh các tổn thương cơ học, bảo tồn cấu trúc và tiềm năng phát triển của phôi sau rã đông.

Để đạt được trạng thái thủy tinh, cần có sự kết hợp của hai yếu tố then chốt: nồng độ cao các CPA, và tốc độ hạ nhiệt - rã đông cực nhanh. Trong thủy tinh hóa, các CPA có khả năng tạo thủy tinh tốt và thấm nhanh qua màng tế bào như dimethyl sulfoxide (DMSO) và ethylene glycol (EG) được sử dụng phổ biến. Tổng nồng độ CPA khoảng 30% theo thể tích được xem là tối ưu, vừa đảm bảo khả năng thủy tinh hóa ổn định trong điều kiện labo, vừa hạn chế nguy cơ độc tính [1]. Ở nồng độ cao, CPA làm tăng độ nhớt môi trường và gây mất nước nội bào, giúp giảm lượng nước tự do và ngăn hình thành tinh thể đá. Đồng thời, quá trình hạ nhiệt và rã đông diễn ra rất nhanh (>10.000°C/phút) để tránh sự hình thành và tái kết tinh tinh thể đá [2]. Trong thực hành labo IVF, nhiều môi trường thủy tinh hóa thương mại đã được phát triển với sự khác nhau về thành phần môi trường đông lạnh, dụng cụ trữ đông và thời gian tiếp xúc. Một trong những quy trình được áp dụng rộng rãi nhất hiện nay là sử dụng Cryotop kết hợp 15% EG (2,7 M) và 15% DMSO (2,1 M) cùng với 0,5 M CPA không thẩm thấu như sucrose hoặc trehalose. Trước khi thủy tinh hóa, noãn hoặc phôi được tiếp xúc với môi trường cân bằng (ES - Equilibration Solution) trong 10 - 15 phút (EG: 1,35 M + DMSO: 1,05 M). Do sự chênh lệch áp suất thẩm thấu giữa môi trường nuôi cấy (280 mOsm/kg) và ES (2.700 mOsm/Kg), nước nội bào nhanh chóng thẩm thấu ra ngoại bào. Đồng thời, CPA thẩm thấu sẽ khuếch tán vào trong nội bào thay thế nước, noãn hoặc phôi co lại tạm thời và hồi phục thể tích khi cân bằng áp suất thẩm thấu. Sau đó, noãn hoặc phôi được chuyển nhanh sang môi trường thủy tinh hóa (VS - Vitrification Solution) trong 1 phút (5.600 mOsm/Kg) để khử nước triệt để trước khi chuyển lên dụng cụ đông lạnh và thủy tinh hóa [2].

Quy trình rã đông diễn ra nhanh chóng để tránh sự tái kết tinh của tinh thể đá, noãn hoặc phôi được chuyển qua lần lượt môi trường giảm dần nồng độ sucrose. Đầu tiên, noãn hoặc phôi được giảm áp suất thẩm thấu từ 5.600 mOsm/Kg xuống 1.280 mOsm/Kg ở 37°C trong môi trường rã đông (TS - Thawing Solution, 1 phút). Tiếp theo là hai giai đoạn bù nước ở nhiệt độ phòng, giảm áp suất thẩm thấu xuống 780 mOsm/Kg trong môi trường pha loãng (Dilution Solution - DS, 3 phút) và 280 mOsm/Kg ở môi trường rửa (Washing Solution - WS, 5 - 6 phút). Thông thường, TS chứa 1,0 M sucrose, DS chứa 0,5 M sucrose và WS là dung dịch đệm HEPES, cho phép kiểm soát tốc độ thẩm thấu nước ngoại bào và kiểm soát sự trương phồng của tế bào trong quá trình tái hydrat hóa [2].

  1. Cơ sở lý thuyết của thủy tinh hóa và rã đông cực nhanh

Hiện nay, thời gian tiếp xúc với CPA ở bước ES trong quy trình thủy tinh hóa vẫn khá dài (10 phút với phôi phân chia, 12 - 13 phút với noãn và phôi nang), làm dấy lên lo ngại về độc tính CPA. Do đó, nhiều nghiên cứu đã hướng đến việc rút ngắn thời gian ES. Hai nghiên cứu của Martinez và cộng sự (2021 - 2024) trên phôi nang bò cho thấy việc rút ngắn ES xuống 3 phút vẫn duy trì hoặc cải thiện tỷ lệ sống và tái nở rộng sau rã đông so với 13 phút. Đặc biệt, biểu hiện gen liên quan đến stress và apoptosis ở nhóm 3 phút thấp hơn so với nhóm 13 phút [3, 4].  Các nghiên cứu in-silico trước đó cũng cho thấy chỉ sau 1 phút tiếp xúc, noãn đã khử nước hiệu quả và kéo dài thời gian sau đó chủ yếu chỉ giúp phục hồi thể tích. Ngoài ra, tại điểm co cực đại (30 - 60 giây), xu hướng hình thành tinh thể đá tương đương với giai đoạn cân bằng truyền thống (9 - 15 phút), củng cố giả thuyết về tính khả thi của quy trình thủy tinh hóa cực nhanh. Mặc dù rút ngắn thời gian ES có thể làm tăng gradient thẩm thấu và áp lực cơ học lên tế bào [1]. Dù chưa có ngưỡng co rõ ràng ở noãn hoặc phôi người, nghiên cứu trên hợp tử chuột cho thấy noãn có thể co lại đến 25% hoặc trương lên đến 290% thể tích đẳng trương mà không làm mất khả năng phát triển, miễn là những thay đổi thể tích này diễn ra từ từ và ở nhiệt độ sinh lý, cho thấy co nguyên sinh không phải là yếu tố duy nhất gây mất khả năng sống [1]. Từ đó, có thể kết luận rằng việc rút ngắn thời gian tiếp xúc với ES là khả thi về mặt lý thuyết và cải thiện hiệu quả thao tác trong quy trình thủy tinh hóa.

Song song với cải tiến ở bước chuẩn bị thủy tinh hóa, các nghiên cứu gần đây cũng tập trung vào việc tối ưu hóa bước rã đông. Mặc dù quy trình rã đông nhiều bước hiện tại vẫn đang mang lại hiệu quả cao nhờ giảm dần nồng độ môi trường để đưa phôi về điều kiện sinh lý, nhưng các phương pháp thay thế như rã đông nhanh hoặc rã đông một bước đang được đề xuất nhằm đơn giản hóa thao tác, hạn chế tác động bên ngoài đến phôi, rút ngắn thời gian và tăng tính nhất quán trong phòng labo. Đây cũng là hướng cải tiến đầy tiềm năng đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhóm nghiên cứu. Một số nghiên cứu cho thấy tốc độ rã đông là yếu tố quyết định tỷ lệ sống sau rã, đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa sự tái kết tinh các tinh thể đá, vốn là nguyên nhân chính gây tổn thương tế bào. Các nghiên cứu thực nghiệm và mô hình in-silico cho thấy phần lớn các CPA được loại bỏ rất nhanh trong bước đầu tiên ở TS và các bước DS, WS không cần thiết để bảo vệ tế bào khỏi sốc thẩm thấu. Các thử nghiệm lâm sàng và tiền lâm sàng cho thấy tỷ lệ sống, phát triển của phôi, tỷ lệ thai lâm sàng ở quy trình rã đông một bước trong TS tương đương hoặc cao hơn so với quy trình nhiều bước [1]. Việc bỏ bước DS và WS giúp rút ngắn quy trình từ 10 - 15 phút xuống còn 1 - 2 phút, giảm nguy cơ thao tác sai, tăng hiệu quả và đồng nhất quy trình trong phòng lab.

  1.  Bằng chứng nghiên cứu

Bên cạnh cơ sở lý thuyết và các dữ liệu thực nghiệm bước đầu, hiệu quả lâm sàng của việc rút ngắn thời gian tiếp xúc ES đã bắt đầu được ghi nhận. Trong một nghiên cứu tiến cứu do Aydin (2022 - 2023) và báo cáo tại hội nghị ESHRE 2024, thực hiện trên 1.241 chu kỳ PGT, kết quả cho thấy tỷ lệ phôi sống sau rã đông đạt 100%, tỷ lệ phôi nguyên bội đạt 61,8% và tỷ lệ thai lâm sàng đạt 65,22%. Nghiên cứu này cũng chưa ghi nhận ảnh hưởng bất lợi của việc rút ngắn thời gian ES lên chất lượng phôi sau rã đông [5].  

Nghiên cứu UFV và URW trên noãn cho thấy, tỷ lệ noãn GV sống sau rã đông (98%) cao hơn so với nhóm thủy tinh hóa và rã đông truyền thống (83,3%). Tỷ lệ noãn trưởng thành trong ống nghiệm đến giai đoạn MII sau 48 giờ không có sự khác biệt giữa các nhóm (52,6 - 58,3%). Đánh giá cấu trúc thoi vô sắc cho thấy noãn MII sau thủy tinh hóa và rã đông duy trì tính toàn vẹn thoi phân bào tương đương giữa hai nhóm [6]. Kết quả nghiên cứu cho thấy UFV và URW đạt tỷ lệ noãn MII sống sau rã đông (94 - 100%) cao hơn có ý nghĩa thống kê so với quy trình thủy tinh hóa truyền thống (80 - 90%; p = 0,003). Noãn MII, bao gồm cả noãn trưởng thành từ giai đoạn GV, vẫn duy trì khả năng phát triển sau hoạt hóa noãn nhân tạo, với tỷ lệ phôi phân chia đạt  54 - 71% và ghi nhận hình thành phôi nang. Trong nhóm noãn trưởng thành, UFV và URW kết hợp hoạt hóa bằng ionophore canxi và 6-DMAP cho tỷ lệ phôi nang 34,9% tương đương với quy trình thủy tinh hóa truyền thống (31,7%), đồng thời bảo tồn tính toàn vẹn của thoi vô sắc [7].

Hiệu quả của kỹ thuật URW cũng được chứng minh nhất quán trong nhiều nghiên cứu lâm sàng. Một nghiên cứu đoàn hệ hồi cứu (01/2022 - 02/2023) so sánh 793 chu kỳ FET áp dụng rã đông một bước (1 phút) với 2.606 chu kỳ rã đông hai bước truyền thống (11 phút) cho thấy tỷ lệ sống sau rã đông ở cả hai nhóm đều đạt 99,5%. Tuy nhiên, nhóm URW ghi nhận tỷ lệ thai lâm sàng và thai đang diễn tiến cao hơn có ý nghĩa thống kê (62,9% và 60,3% so với 59,9% và 55,4%; p < 0,05), đồng thời tỷ lệ sảy thai thấp hơn rõ rệt (4,2% so với 7,6%; p < 0,01) [8]. Kết quả này phù hợp với các báo cáo khác, trong đó Liebermann (2024) cho thấy rã đông nhanh giúp tăng tỷ lệ thai lâm sàng và làm tổ, đồng thời giảm tỷ lệ sảy thai, không phụ thuộc vào tuổi mẹ, chất lượng phôi hay phương pháp hỗ trợ sinh sản [9]. Masashi (2025) cũng ghi nhận kết quả tích cực khi áp dụng rã đông 1 phút cho cả phôi giai đoạn phân chia và phôi nang [10]. Tương tự, Lammers (2025) sử dụng môi trường W1B (Vitrolife) với quy trình rã đông 2 phút cho thấy tỷ lệ sống sau rã đông, phôi tái nở rộng, thai lâm sàng và trẻ sinh sống tương đương với quy trình chuẩn, đồng thời không ảnh hưởng đến biểu hiện các gen vạn năng [11]. Tổng hợp các dữ liệu hiện có cho thấy kỹ thuật UFV và URW là một hướng cải tiến đầy tiềm năng trong thực hành IVF, vừa tối ưu hóa quy trình thao tác trong labo vừa cải thiện kết quả lâm sàng.

  1. Thách thức và định hướng nghiên cứu tương lai

Mặc dù các quy trình UFV và URW cho thấy nhiều ưu điểm về hiệu quả thao tác và kết quả lâm sàng, tuy nhiên vẫn còn tồn tại một số thách thức cần được cân nhắc. Trước hết, dữ liệu theo dõi dài hạn về sức khỏe và sự phát triển của trẻ sinh ra từ phôi hoặc noãn được xử lý bằng các quy trình này hiện còn hạn chế. Bên cạnh đó, sự không đồng nhất về trang thiết bị, điều kiện phòng labo và trình độ chuyên môn của nhân sự giữa các trung tâm IVF có thể ảnh hưởng đến tính tái lập và độ tin cậy của kết quả. Việc triển khai thành công các quy trình rút ngắn cũng đòi hỏi đội ngũ chuyên viên phôi học được đào tạo bài bản và tuân thủ nghiêm ngặt quy trình thao tác nhằm đảm bảo độ chính xác.

Để quy trình UFV và URW có thể được công nhận và áp dụng như một chuẩn mực mới trong thực hành tại các labo IVF, cần có thêm các nghiên cứu cơ bản và lâm sàng quy mô lớn. Trọng tâm nghiên cứu bao gồm chuẩn hóa quy trình, xác định thành phần, nồng độ CPA và thời gian tiếp xúc tối ưu nhằm cân bằng giữa hiệu quả bảo vệ và độc tính tế bào. Đồng thời, các nghiên cứu theo dõi dài hạn cần được triển khai để đánh giá toàn diện sức khỏe và sự phát triển sau sinh của trẻ. Ngoài ra, việc ứng dụng các công nghệ tự động hóa là một hướng đi tiềm năng, giúp giảm sai sót thao tác và tăng tính đồng nhất giữa các trung tâm. Cuối cùng, nghiên cứu và phát triển các CPA thế hệ mới với độc tính thấp nhưng vẫn đảm bảo hiệu quả bảo vệ tế bào sẽ đóng vai trò quan trọng trong việc hoàn thiện quy trình trong tương lai.

  1.  Kết luận

Các quy trình UFV và URW noãn, phôi người được xem là một bước tiến quan trọng trong lĩnh vực hỗ trợ sinh sản. Quy trình này cho thấy hiệu quả tương đương, thậm chí vượt trội so với các quy trình truyền thống, đồng thời góp phần rút ngắn thời gian thao tác và giảm thiểu nguy cơ tổn thương tế bào. Tuy nhiên, để có thể áp dụng rộng rãi trong thực hành lâm sàng, vẫn cần thêm các nghiên cứu đa trung tâm với thời gian theo dõi dài hạn nhằm khẳng định tính an toàn, độ tin cậy và xây dựng các quy trình chuẩn hóa.

Tài liệu tham khảo:

  1. Martinez-Rodero, I., Gallardo, M., Pisaturo, V., Scarica, C., Conaghan, J., Liebermann, J., & Cuevas-Saiz, I. (2025). The development of shorter protocols for vitrification and post-warming dilution of human oocytes and embryos: A narrative review. Reproductive BioMedicine Online, 104857.

  2. Sciorio, R., Tramontano, L., Campos, G., Greco, P. F., Mondrone, G., Surbone, A., ... & Fleming, S. (2024). Vitrification of human blastocysts for couples undergoing assisted reproduction: an updated review. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 12, 1398049.

  3. Martínez-Rodero, I., García-Martínez, T., Ordóñez-León, E. A., Vendrell-Flotats, M., Olegario Hidalgo, C., Esmoris, J., ... & Mogas, T. (2021). A shorter equilibration period improves post-warming outcomes after vitrification and in straw dilution of in vitro-produced bovine embryos. Biology, 10(2), 142.

  4. Martínez-Rodero, I., Diaz-Muñoz, J., Higgins, A. Z., Béjar, M. L., Mogas, T., & García-Martínez, T. (2024). In silico-designed vitrification protocols: an approach to improve survival of in vitro produced-bovine embryos. Reproduction, 167(6).

  5. Aydin, B., Hudkova, D., Maggiotto, G., Kal, N. S., Osmanllari, U., Unsal, E., ... & Babarikova, V. (2024, July). Human oocyte survival, early embryo development, metabolic fingerprinting, and pregnancy outcomes following ultra-rapid or standard vitrification and thawing. In HUMAN REPRODUCTION (Vol. 39, pp. I171-I172). GREAT CLARENDON ST, OXFORD OX2 6DP, ENGLAND: OXFORD UNIV PRESS.

  6. Schiewe, M. C., Reichelderfer, R., Wozniak, K., De Romana, C., Nordbak, M., Baek, K., & Chung, K. (2024). Ultra-fast vitrification and rapid elution of human oocytes: part I. germinal vesicle model validation. Reproductive BioMedicine Online, 49(6), 104691.

  7. Wozniak, K., Reichelderfer, R., Ghaemi, S., Hupp, D., Fuzesi, P., Ringler, G., ... & Schiewe, M. C. (2024). Ultra-fast vitrification and rapid elution of human oocytes: Part II–verification of blastocyst development from mature oocytes. Reproductive BioMedicine Online, 49(6), 104690.

  8. Hrvojevic, K., Uhler, M. L., Hirshfeld-Cytron, J., Brohammer, R., Wagner, Y., Susralski, A., ... & Liebermann, J. (2023). FAST AND FURIOUS: PREGNANCY OUTCOME WITH A RAPID WARMING PROTOCOL. Fertility and Sterility, 120(4), e59.

  9. Liebermann, J., Hrvojevic, K., Hirshfeld-Cytron, J., Brohammer, R., Wagner, Y., Susralski, A., ... & Uhler, M. (2024). Fast and furious: pregnancy outcome with one-step rehydration in the warming protocol for human blastocysts. Reproductive BioMedicine Online, 48(4), 103731.

  10. Shioya, M., Hashizume, R., Okabe-Kinoshita, M., Kojima, K., Nishi, S., Nakano, S., ... & Takahashi, K. (2025). One-step warming of vitrified human cleavage and blastocyst stage embryos does not adversely impact embryo survivability and subsequent developmental potential. Human Reproduction, 40(2), 261-269.

  11. Lammers, J., Reignier, A., Loubersac, S., Chaillot, M., & Freour, T. (2025). Ultra-Fast Warming Procedure of Vitrified Blastocysts Results in Maintained Embryology and Clinical Outcomes. Reproductive Sciences, 32(2), 495-501.