Ths. Lê Thị Bích Phượng- IVFMD Phú Nhuận, Bệnh viện Mỹ Đức Phú Nhuận

Giới thiệu
Đông lạnh giao tử và phôi là kỹ thuật không thể thiếu trong hỗ trợ sinh sản. Trong đó, đông lạnh noãn chỉ mới được cải thiện và phát triển trong vài thập kỷ gần đây do đặc tính nhạy cảm, cấu trúc lớn cũng như các kết quả điều trị vẫn còn thấp. Tuy nhiên, do vấp phải các vấn đề tôn giáo và pháp lý trong quá trình tạo và trữ phôi, cũng như sự phát triển của các chương trình bảo tồn khả năng sinh sản ở nữ giới, mà kỹ thuật đông lạnh noãn ngày càng được nghiên cứu nhiều và quy trình cũng được cải thiện đáng kể. Cho đến nay, quy trình đông lạnh noãn đã được thiết lập và được công nhận là quy trình thực nghiệm cũng như được chỉ định phổ biến tại các trung tâm IVF trên toàn thế giới. Đông lạnh noãn cho phép trì hoãn quá trình sử dụng noãn, giúp phụ nữ kéo dài khả năng sinh sản và tự chủ hơn trong cuộc sống. Ngoài ra, kỹ thuật này cũng mang lại lợi ích cho những trường hợp bệnh nhân có nguy cơ quá kích buồng trứng hoặc đáp ứng kém với kích thích buồng trứng, bệnh nhân ung thư muốn bảo tồn khả năng sinh sản trước khi thực hiện hoá trị và xạ trị hoặc thành lập ngân hàng noãn. Vì noãn có một cấu trúc đặc thù dễ nhạy cảm với nhiệt độ lạnh và dễ bị ảnh hưởng bởi tổn thương lạnh do noãn có kích thước lớn, hàm lượng nước cao và cấu trúc nội bào đặc biệt. Do đó, biết được những tác động của kỹ thuật đông lạnh- rã đông noãn lên chất lượng noãn là điều cần thiết. Bài viết này nhằm trình bày tổng quan những tác động của quy trình đông lạnh lên chất lượng noãn sau đông lạnh- rã đông.

Ảnh hưởng của quá trình đông lạnh lên tế bào chất
Yếu tố chính ảnh hưởng đến tế bào chất của noãn sau quá trình đông lạnh rã đông là sự hình thành tinh thể đá và quá trình tổn thương lạnh. Noãn có cấu trúc đặc biệt nhạy cảm với quá trình làm lạnh nên rất dễ bị tổn thương. Vì noãn có kích thước lớn nên tỉ lệ diện tích trên thể tích nhỏ, chứa hàm lượng nước cao với cấu trúc và các thành phần nội bào đặc biệt đã tạo thành một mạng lưới sinh học khó khăn cho quá trình đông lạnh- rã đông. Giảm nhiệt độ đột ngột có thể dẫn đến tổn thương do sốc lạnh ở các cấu trúc chức năng bên trong noãn như tính thấm của màng, khung xương tế bào hoặc trục phân bào. Ngoài ra, do noãn có chứa một lượng nước lớn nên có nguy cơ hình thành tinh thể đá trong suốt quá trình làm lạnh, từ đó làm tổn thương tế bào và dẫn đến chết tế bào [1]. Tỉ lệ diện tích bề mặt trên thể tích của noãn nhỏ là giới hạn chính của quy trình đông lạnh noãn. Do đó, noãn cần nhiều thời gian để đạt được trạng thái cân bằng thẩm thấu khi tiếp xúc với chất bảo vệ đông lạnh (CPA) cũng như tốc độ làm lạnh tối ưu ở noãn thấp hơn đáng kể so với các tế bào khác. Một vấn đề cần lưu ý khác khi đông lạnh noãn là sự thay đổi thể tích tế bào do quá trình trao đổi nước cân bằng CPA, sự trao đổi nước ngoại bào và ngoại bào có thể làm biến động mạnh đến thể tích tế bào noãn, dẫn đến vỡ tế bào hoặc tổn thương cấu trúc bên trong tế bào, làm giảm kết quả điều trị sau rã. Do đó để tránh sốc thẩm thấu, sự kết hợp giữa nồng độ CPA, tốc độ làm lạnh và thao tác nhẹ nhàng, cẩn thận là ba yếu tố quan trọng quyết định sự thành công của một chu kỳ đông lạnh- rã đông noãn [2].

Ảnh hưởng của quá trình đông lạnh lên hình thái noãn
Các nghiên cứu đánh giá về tác động của quy trình đông lạnh- rã đông lên hình thái của noãn người cho thấy có sự hiện diện của không bào trên noãn người sau rã đông và tỉ lệ không bào trên noãn đông lạnh bằng kỹ thuật thuỷ tinh hoá thấp hơn kỹ thuật đông lạnh chậm. Ngoài ra, sự kết tụ của mạng lưới nội chất trơn (SER) cũng được quan sát thấy ở noãn trữ rã bằng kỹ thuật đông lạnh chậm và thuỷ tinh hoá. Sự xuất hiện không bào và SER ở noãn người sau quy trình đông lạnh có thể ảnh hưởng lên quá trình thụ tinh cũng như tiềm năng phát triển ở phôi do làm rối loạn quá trình cân bằng Ca2+ nội môi [3]. Một giả thuyết khác về sự biến đổi siêu cấu trúc của ti thể và lưới nội chất trơn có thể gây ra bởi một số điều kiện đông lạnh hoặc do tiếp xúc với CPA, mà có thể ảnh hưởng đến cơ chế sinh lý liên quan đến tín hiệu Ca2+ trong quá trình thụ tinh, từ đó làm giảm tỉ lệ thụ tinh ở noãn đông lạnh [4]. Tuy nhiên, tác động thật sự của các hiện tượng này lên sinh lý của noãn vẫn chưa được xác nhận, và cũng cần thêm nhiều bằng chứng hơn để xác nhận lại trên thực hành thực tế.

Ảnh hưởng của quá trình đông lạnh lên màng zona
Ở giai đoạn MII, quá trình trưởng thành noãn đã được hoàn tất nên các hạt vỏ noãn được sắp xếp ở vị trí màng noãn. Trong quá trình hoà hợp giao tử khi thụ tinh, các hạt vỏ sẽ giải phóng vật chất bên trong ra khoảng không quanh noãn. Quá trình xuất bào của các hạt gây ra sự biến đổi sinh hoá của khối tế bào noãn ngoại bào, đặc biệt là sự thay đổi trong kết cấu của ZP và làm cứng màng. Dưới tác động của quy trình đông lạnh- rã đông, người ta thấy rằng có sự giảm đáng kể số lượng các hạt vỏ. Quá trình loại bỏ các hạt vỏ noãn làm màng zona cứng lại làm ảnh hưởng đến khả năng thụ tinh bình thường của noãn [5].

Ảnh hưởng của quá trình đông lạnh lên thoi vô sắc
Tính dễ tổn thương của noãn MII với quy trình đông lạnh- rã đông có liên quan mật thiết với sự hiện diện của thoi vô sắc- bào quan rất nhạy cảm với sự thay đổi nhiệt độ. Sự nhạy cảm của thoi vô sắc được chứng minh rằng sự đứt đoạn không thể hồi phục của noãn có thể diễn ra ngay khi noãn tiếp xúc thoáng qua với nhiệt độ phòng. Nên dù các nghiên cứu trước đây có báo cáo rằng cấu hình thoi vô sắc có thể được bảo toàn trong quy trình đông lạnh khi tiếp xúc với CPA, thì một số nghiên cứu khác lại cho thấy cấu trúc này lại bị mất sau khi noãn được rã đông. Tuy nhiên, các nghiên cứu sau đó đã nhấn mạnh khả năng hồi phục bằng cách sắp xếp lại của các thoi vô sắc sau đông lạnh [6].

Ảnh hưởng của quá trình đông lạnh lên phân mảnh DNA
Một giả định sinh học cho tiềm năng phát triển kém của noãn có liên quan đến việc tăng tỉ lệ DNA phân mảnh sau đông lạnh được thực hiện trên noãn chuột. Tuy nhiên trong các nghiên cứu thực hiện trên noãn người, vẫn chưa có nghiên cứu nào chứng minh được rằng có sự tăng của DNA phân mảnh hoặc các dấu hiệu apoptosis sau đông lạnh [7]. Trong một nghiên cứu khác, nhóm tác giả quan sát thấy DNA phân mảnh tăng đáng kể ở noãn đông lạnh bằng kỹ thuật thuỷ tinh hoá.  Cho đến nay, tác động của đông lạnh lên tính toàn vẹn DNA của noãn vẫn đang được nghiên cứu và chưa có kết luận rõ ràng trên noãn người.

Ảnh hưởng của quá trình đông lạnh lên trinh sản
Bên cạnh những tác động liên quan đến cấu trúc tế bào, nhiều giả thuyết còn cho rằng nguy cơ kích hoạt trinh sản ở noãn sau khi tiếp xúc CPA có thể diễn ra. Tuy nhiên nghiên cứu của Gook và cộng sự đã xác nhận lại rằng nguy cơ hoạt hoá trinh sản ở noãn đông lạnh không có sự khác biệt so với noãn tươi [6].

Ảnh hưởng của quá trình đông lạnh lên lão hoá in vitro
Các nghiên cứu liên quan đến các tín hiệu trao đổi chất của noãn cho thấy có sự giảm đáng kể yếu tố thúc đẩy trưởng thành ở noãn người sau đông lạnh. Những quan sát này cung cấp các chỉ định liên quan đến ứng dụng lâm sàng của đông lạnh noãn. Người ta thấy rằng hoạt động của yếu tố thúc đẩy trưởng thành dường như không bị ảnh hưởng trong giai đoạn sớm sau rã đông, nên việc nuôi cấy noãn sau rã nên được giới hạn trong khoảng 1 giờ để tránh mất đi tiềm năng của các cấu trúc của thoi vô sắc.

Ảnh hưởng của quá trình đông lạnh lên di truyền và thượng di truyền của noãn
Tác động của quá trình đông lạnh lên những thay đổi liên quan đến di truyền và thượng di truyền đã được nghiên cứu trong 10 năm qua. Một nghiên cứu vào năm 2012 cho thấy đông lạnh chậm có tương quan đến giảm điều hoà của các gen tham gia vào quá trình duy trì cấu trúc nhiễm sắc thể (Kinesin-like protein; KIF2C và KIF3A) và điều hoà chu trình tế bào (Checkpoint Kinase 2, CHEK2; và Cyclin Dependent Kinase Inhibitor 1B, CDKN1B), có thể ảnh hưởng đến khả năng phát triển của tế bào noãn [8]. Một nghiên cứu khác cho thấy các gen mã hoá cho các protein cần thiết cho sự phát triển và chức năng đặc thù của noãn đông lạnh bằng kỹ thuật thuỷ tinh hoá (BMP15, GDF9, FIGLA, POU5f1-OCT4…) không bị thay đổi sau quá trình đông lạnh, trữ đông [9]. Một dấu hiệu tiềm ẩn khác của tổn thương lạnh có thể xuất hiện là sự thay đổi của tình trạng thượng di truyền của phôi có nguồn gốc từ noãn đông lạnh. Các nghiên cứu trên mô hình động vật cho thấy có những thay đổi thượng di truyền như sự thay đổi của mức độ methyl hoá DNA cũng như sự sửa đổi histone. Trong nghiên cứu trên noãn hiến tặng, nhóm tác giả đã chỉ ra rằng mức độ methy hoá DNA không khác biệt giữa noãn tươi và noãn trữ. Một nghiên cứu khác chỉ ra rằng có ít nhất 22 miRNA biểu hiện khác nhau giữa noãn tươi và noãn trữ [3]. Tuy nhiên các kết quả vẫn còn gây nhiều tranh cãi và vẫn chưa biết được liệu rằng những thay đổi thượng di truyền trên có ảnh hưởng đến sức khoẻ lâu dài hay không [6].

Kết luận
Đông lạnh noãn là một kỹ thuật quan trọng và cần thiết trong thực hành lâm sàng hiện tại. Kỹ thuật này là lựa chọn khả thi cho phụ nữ muốn bảo tồn khả năng sinh sản với lý do y tế hoặc phi y tế. Hiện nay, nhiều bằng chứng cho thấy đông lạnh noãn có tác động đáng kể đến chất lượng noãn sau đông lạnh- rã đông bao gồm cả đặc tính vật lý và sinh học của noãn. Do đó, quy trình đông lạnh- rã đông noãn nên được thực hiện cẩn thận và nghiêm ngặt để tránh làm ảnh hưởng đến cấu trúc noãn bào, từ đó ảnh hưởng đến tiềm năng phát triển của phôi và thai sau này.

Tài liệu tham khảo
[1]      J. Kopeika, A. Thornhill, and Y. Khalaf, “The effect of cryopreservation on the genome of gametes and embryos: Principles of cryobiology and critical appraisal of the evidence,” Hum Reprod Update, vol. 21, no. 2, pp. 209–227, 2015, doi: 10.1093/humupd/dmu063.
[2]      B. P. Best, “Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions,” Rejuvenation Res, vol. 18, no. 5, pp. 422–436, 2015, doi: 10.1089/rej.2014.1656.
[3]      T. Tharasanit and P. Thuwanut, “Oocyte cryopreservation in domestic animals and humans: Principles, techniques and updated outcomes,” Animals, vol. 11, no. 10, pp. 1–17, 2021, doi: 10.3390/ani11102949.
[4]      G. Coticchio, M. A. Bonu, R. Sciajno, E. Sereni, V. Bianchi, and A. Borini, “Truths and myths of oocyte sensitivity to controlled rate freezing,” Reprod Biomed Online, vol. 15, no. 1, pp. 24–30, 2007, doi: 10.1016/S1472-6483(10)60687-6.
[5]      R. Gualtieri, M. Iaccarino, V. Mollo, M. Prisco, S. Iaccarino, and R. Talevi, “Slow cooling of human oocytes: ultrastructural injuries and apoptotic status,” Fertil Steril, vol. 91, no. 4, pp. 1023–1034, 2009, doi: 10.1016/j.fertnstert.2008.01.076.
[6]      B. Iussig et al., “A brief history of oocyte cryopreservation: Arguments and facts,” Acta Obstet Gynecol Scand, vol. 98, no. 5, pp. 550–558, 2019, doi: 10.1111/aogs.13569.
[7]      M. Martínez-Burgos et al., “Vitrification versus slow freezing of oocytes: Effects on morphologic appearance, meiotic spindle configuration, and DNA damage,” Fertil Steril, vol. 95, no. 1, pp. 374–377, 2011, doi: 10.1016/j.fertnstert.2010.07.1089.
[8]      S. Stigliani, S. Moretti, P. Anserini, I. Casciano, P. L. Venturini, and P. Scaruffi, “Storage time does not modify the gene expression profile of cryopreserved human metaphase II oocytes,” Human Reproduction, vol. 30, no. 11, pp. 2519–2526, 2015, doi: 10.1093/humrep/dev232.
[9]      C. Di Pietro et al., “Molecular profiling of human oocytes after vitrification strongly suggests that they are biologically comparable with freshly isolated gametes,” Fertil Steril, vol. 94, no. 7, pp. 2804–2807, 2010, doi: 10.1016/j.fertnstert.2010.04.060.

Từ khóa: Tác động của kỹ thuật đông lạnh lên cấu trúc noãn