BS. Quách Thị Hoàng Oanh

Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học, Bệnh viện Từ Dũ

TÓM TẮT

Đặt vấn đề: Bệnh DMD là bệnh di truyền thần kinh cơ phổ biến nhất. Gần 65% trường hợp là do đột biến xóa hoặc lặp đoạn gen DMD. Mục tiêu: Xác định giá trị của kỹ thuật MLPA trong chẩn đoán đột biến xóa đoạn gen DMD gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne. Phương pháp: 45 mẫu DNA của 39 bệnh nhân DMD nam và 6 mẫu của thân nhân được chẩn đoán xác định trên lâm sàng và xét nghiệm multiplex PCR là bệnh DMD cùng với 40 mẫu nam bình thường được khảo sát 79 exon của gen DMD hỗn hợp probe Salsa MLPA P034A2 và P035A2, điện di mao quản bằng CEQ 8000 và phân tích tự động bằng phần mềm Gene Marker. Kết quả: MLPA có độ nhạy 43,6%, độ đặc hiệu 100%, giá trị tiên đoán dương 100% và giá trị tiên đoán âm 64,5%, cho phép xác định chính xác kích thước của đoạn DNA bị đột biến. Tỉ lệ đột biến xóa đoạn gen phát hiện bằng MLPA là 43,6%. Kết luận: Kỹ thuật MLPA giúp phát hiện nhanh chóng, toàn diện các đột biến xóa đoạn gen DMD và hứa hẹn hiệu quả cao khi ứng dụng vào chẩn đoán trước sinh.

Từ khóa: bệnh loạn dưỡng cơ, Duchenne, bệnh di truyền, đột biến gen, kỹ thuật MLPA.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD) là bệnh di truyền thần kinh cơ phổ biến nhất, xuất độ khoảng 1/3.500 trẻ trai sinh sống, khởi phát sớm từ 2-3 tuổi, tiến triển nhanh dẫn đến mất khả năng vận động và tử vong ở lứa tuổi 20 ^[6]. Bệnh gây ra bởi đột biến gen dystrophin (gen DMD) có chiều dài 2.400kb với 79 exon ở vị trí Xp21.2. Khoảng 33-65% trường hợp bệnh DMD là do đột biến xóa đoạn hoặc lặp đoạn gen DMD xảy ra tập trung ở hai vùng nóng ở đầu 5’ (exon 3-20) và vùng trung tâm (exon 44-55) ^[7].

Chẩn đoán đột biến xóa đoạn gen trước đây thường sử dụng kỹ thuật Southern blot và multiplex PCR mất nhiều công và thời gian ^[5], trong khi nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật realtime PCR còn rất hạn chế ^[4]. Các cơ sở chẩn đoán tại Việt Nam thường sử dụng kỹ PCR hoặc multiplex PCR ^[1,2,4] .

Gần đây, kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) ra đời với khả năng khảo sát đến 45 vị trí DNA đích khác nhau trong một phản ứng. MLPA được ứng dụng trong chẩn đoán đột biến xóa đoạn gen DMD rất hiệu quả ^[8]. Vì thế, việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật này vào chẩn đoán bệnh DMD, đặc biệt là ở giai đoạn trước sinh cho các gia đình có tiền sử bệnh là rất cần thiết tại Việt Nam.

MỤC TIÊU

Xác định giá trị của kỹ thuật MLPA trong chẩn đoán đột biến xóa đoạn gen DMD trên các bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne tại Bệnh viện Từ Dũ.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thiết kế nghiên cứu

Test chẩn đoán

Đối tượng

Các trường hợp nam giới bị bệnh DMD hoặc phụ nữ có tiền sử gia đình có con trai bệnh DMD.

Vật liệu

Bệnh phẩm là 3mL máu tĩnh mạch ngoại vi chống đông bằng EDTA. DNA được ly trích từ 200mL máu toàn phần theo phương pháp cột lọc bằng QiaAmp DNA blood mini kit (Qiagen) và hòa tan trong dung dịch TE 1x.

Kỹ thuật MLPA

Đột biến xóa đoạn gen DMD được khảo sát bằng kit Salsa MLPA (MRC-Holland) có chứa 80 probe cho 79 exon đích và exon DP427c chia đều vào 2 hỗn hợp probe P034A2 và P035A2 ^[5,6]. Ngoài ra, mỗi hỗn hợp còn chứa thêm 5 probe chứng (bảng 1). 50-200ng DNA của mẫu khảo sát được biến tính ở 98⁰C x 5’, làm lạnh trên đá rồi trộn với 3ml hỗn hợp probe và MLPA buffer theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hỗn hợp DNA và probe này sau đó được ủ lai ở 95⁰C x 1’ và 60⁰C x 16 giờ hoặc qua đêm. Phản ứng nối ghép sau lai được thực hiện với 32ml hỗn hợp Ligase-65 và buffer ở 54⁰C x 15’ và bất hoạt ở 98⁰C x 5’.

10mL sản phẩm nối ghép được trộn kỹ với 30mL PCR buffer và đặt vào máy luân nhiệt ở 60⁰C. Liền ngay sau đó 10ml hỗn hợp phản ứng có chứa dNTPs, DNA polymerase và primer (primer xuôi: 5’-Cy5-GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3’, primer ngược: 5’-GTGCCAGCA AGATCCAATCTAGA-3’) được thêm vào rồi thực hiện luân nhiệt với chu trình (95⁰C x 30” + 60⁰C x 30” + 72⁰C x 60”) x 35 chu kỳ + 72⁰C x 20’ và giữ ở 4⁰C bằng máy Master Cycler ProS (Eppendorf).

Sản phẩm sau khuếch đại được điện di phân tách đoạn trên hệ thống CEQ 8000 (Beckman Coulter) ở điều kiện: 2mL sản phẩm luân nhiệt + 0,5mL Size standard 600 + 32mL SLS; biến tính 90⁰C x 20’’; điện thế bơm mẫu 2kV x 30’’; điện thế điện di 4,8kV x 60’; nhiệt độ mao quản 50⁰C. Kết quả sau điện di được xuất dưới dạng file .esd và phân tích bằng phần mềm GeneMarker version 1.85 (SoftGenetics). Kết quả phân tích định lượng được biểu diễn dưới dạng biểu đồ và bảng. Sản phẩm khuếch đại của mỗi probe tương ứng với exon khảo sát sẽ được thể hiện bằng các đỉnh với kích thước và cường độ RFU khác nhau trên biểu đồ. Nếu có đột biến xóa đoạn thì hiện tượng lai và ghép nối của các probe tương ứng không xảy ra nên không tạo được sản phẩm khuếch đại khi luân nhiệt. Vì ở người nam chỉ có 1 gen DMD, nên sẽ không có sự hiện diện của các đỉnh tương ứng với các vị trí exon xóa đoạn (hình 1).

Bảng 1. Kích thước probe đặc hiệu các DMD exon trong hỗn hợp P034A2 và P035A

Probe (bp)

DMD exon

Probe (bp)

DMD exon

1 Các tin khác cùng chuyên mục: Phát hiện tổn thương tiền ung thư bằng test acid acetic - Ngày đăng: 20-11-2012 Siêu âm tim thai: Hiện tại và tương lai - Ngày đăng: 15-10-2012 Giá trị siêu âm trong chẩn đoán phân biệt độ lành ác của bướu vú - Ngày đăng: 26-09-2012 Khảo sát tình hình ung thư cổ tử cung ở phụ nữ 18-55 tuổi tại tỉnh Ninh Thuận - Ngày đăng: 13-09-2012 Hiệu quả thuốc kháng Retrovirus và sữa thay thế trong dự phòng lây truyền HIV từ mẹ sang con - Ngày đăng: 23-08-2012 Kiến thức, thái độ và hành vi của sản phụ nhiễm HIV về phòng lây truyền HIV từ mẹ sang con - Ngày đăng: 19-07-2012 Bệnh đái tháo đường và thai kỳ - Ngày đăng: 04-07-2012 Tiểu đêm - Ngày đăng: 07-06-2012 Chuyển giới tính - Ngày đăng: 17-05-2012 Tổng quan và triển vọng của Phẫu thuật nội soi trong phụ khoa - Ngày đăng: 10-06-2006 Hội chứng buồng trứng đa nang: Điều trị bằng phẩu thuật nội soi đốt điểm buồng trứng - Ngày đăng: 10-06-2006 Hiệu quả của phẫu thuật nội soi trong điều trị hiếm muộn do nguyên nhân vòi trứng - Ngày đăng: 10-06-2006 TIN CẬP NHẬT Tin cộng đồng Tin trong nước Tin quốc tế TIN CHUYÊN NGÀNH Sản khoa và nhi sơ sinh Phụ khoa Mãn kinh Nam khoa Vô sinh và hỗ trợ sinh sản Khác LỊCH HỘI NGHỊ MỚI Năm 2020 TB I - Hội nghị Vô sinh và Kỹ thuật Hỗ trợ sinh sản lần 11 New World Saigon Hotel (Số 76 Lê Lai, Phường Bến Nghé, Quận 1, ... Năm 2020 Hội thảo Ứng dụng của Siêu âm trong Phụ khoa, Hiếm muộn và Hỗ trợ sinh sản Caravelle Hotel Saigon, chiều thứ bảy 20.4 và chủ nhật 21.4.2024 Năm 2020 [Tham khảo] Hội thảo chuyên đề Những vấn đề mới trong hỗ trợ sinh sản Khách sạn Caravelle Saigon, Chủ nhật 21.1.2024 (9:00 - 11:15) GIỚI THIỆU SÁCH MỚI Giới thiệu Y học sinh sản số 70 - Chấm dứt thai kỳ: thời điểm và các biện pháp Sách dự kiến phát hành đầu tháng 6.2024 Mời đón đọc Y học sinh sản số 69 - Hội chứng buồng trứng đa nang Sách ra mắt ngày 9 . 3 . 2024 và gửi đến quý hội viên trước ... Mời đón đọc Y học sinh sản số 68 (quý IV/2023) - Các bệnh lý do bất thường nhiễm sắc thể và gen Y học sinh sản số 68 ra mắt ngày 25 . 12 . 2023 và gửi đến quý ... Hội viên liên kết Bạch kim 2024 Hội viên liên kết Vàng 2024 Hội viên liên kết Bạc 2024 FACEBOOK HỘI NỘI TIẾT SINH SẢN VÀ VÔ SINH TPHCM (HOSREM) Văn phòng HOSREM: Phòng 3.3, tầng 3, tòa nhà Thanh Niên, số 345/134 Trần Hưng Đạo, P. Cầu Kho, Quận 1, TPHCM Điện Thoại: 0933 456 650 (có Zalo) Email: [email protected] Số Tài khoản: 060005976475 | Chủ tài khoản: Hội Nội tiết sinh sản và Vô sinh TPHCM | Ngân hàng: Sacombank – Chi nhánh Cao Thắng. Bản quyền © thuộc về Hội Nội tiết sinh sản và vô sinh TP.HCM (HOSREM). All rights reserved. Giấy phép số: 21/GP-ICP-STTTT do Sở Thông tin và Truyền thông TP.HCM cấp ngày 28 tháng 3 năm 2014. Thống kê truy cập Online 0 Hôm nay 0 Tháng này 0 Tất cả 8602656 Chỉ dành cho Hội viên đã Đăng ký. Username Password