ThS. Võ Như Thanh Trúc – Chuyên viên phôi học – IVFAS

Giới thiệu
Tiền sản giật (TSG) là một rối loạn phức tạp được đặc trưng bởi triệu chứng chính là tăng huyết áp và protein niệu sau 20 tuần của thai kỳ. Đây là một trong những nguyên nhân phổ biến nhất của bệnh sơ sinh và tử vong chu sinh, chiếm 5% –8% trên toàn thế giới. Cơ chế bệnh sinh của TSG rất phức tạp và vẫn chưa được làm sáng tỏ đầy đủ. Một số nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng rối loạn chức năng nội mô hệ thống là cơ chế cơ bản của cơ chế bệnh sinh của TSG. Hiện nay, tổn thương tế bào nội mô đang được quan tâm trong nghiên cứu cơ chế bệnh sinh TSG. Nhiều nghiên cứu đã báo cáo về sự rối loạn điều hòa quá trình apoptosis và autophagy của tế bào nội mô có liên quan đến từng bước của quá trình sinh bệnh TSG. Việc điều chỉnh tăng alpha-actinin-4 (ACTN4) ức chế đáng kể quá trình chết tế bào nội mô thông qua việc điều chỉnh con đường p38-mitogen hoạt hóa protein kinase / p53 trong TSG. Hơn nữa, các yếu tố bất lợi, chẳng hạn như những yếu tố liên quan đến sự hình thành mạch, có thể tồn tại trong máu của mẹ và thai nhi trong quá trình TSG, có thể dẫn đến tổn thương tế bào nội mô để hạn chế chức năng của nội mạc mạch máu.
 
Fibronectin 1 (FN1) là một glycoprotein tham gia vào sự liên kết tế bào, phân bố rộng rãi trong màng tế bào khỏe mạnh, ở cấu trúc mạch và lớp tế bào cơ trơn. Có hai dạng FN1 là hòa tan và không hòa tan. Một số nghiên cứu cho rằng FN1 trong huyết tương có thể đóng vai trò như một dấu hiệu của tổn thương nội mô. Đặc biệt, nồng độ FN1 trong huyết tương được báo cáo là tăng cao ở những người bị TSG, cho thấy FN1 trong huyết tương là một dấu hiệu có giá trị tiềm năng để dự đoán TSG. Zhao và cộng sự (2017) đã cho thấy FN1 có thể thúc đẩy sự phát triển của TSG bằng cách điều chỉnh sự biệt hóa, quá trình apoptosis và sự xâm nhập của các nguyên bào sinh dưỡng ngoại vi của con người. Do đó, giả thuyết rằng việc giảm biểu hiện của FN1 có thể là một mục tiêu để ngăn ngừa rối loạn chức năng nội mô trong TSG. Tuy nhiên, số lượng các báo cáo nghiên cứu vai trò tiềm năng và cơ chế hoạt động của FN1 trong sinh lý tế bào nội mô mạch máu vẫn còn hạn chế.
 
Trong nghiên cứu này, nồng độ FN1 trong huyết tương ở phụ nữ mang thai bị TSG được đánh giá để xác định mối tương quan giữa bệnh sinh TSG và FN1. Sau đó, tế bào nội mô tĩnh mạch rốn người (HUVECs) được nuôi cấy với huyết thanh thu được từ bệnh nhân TSG để bắt chước môi trường bên trong của quá trình TSG và để khám phá các tác động cơ học của FN1 đối với quá trình apoptosis và autophagy của HUVECs.
 
Vật liệu và phương pháp
Đối tượng nghiên cứu
80 thai phụ được chẩn đoán TSG tại Bệnh viện Nhân dân tỉnh Hà Nam từ tháng 1 năm 2016 đến tháng 1 năm 2019, được phân vào nhóm TSG nhẹ (MP; n = 48) và TSG nặng (SP; n = 32), theo Hướng dẫn chẩn đoán trong Ủy ban ACOG về Bản tin thực hành-Sản khoa (2002). Ngoài ra, 40 phụ nữ mang thai khỏe mạnh (20–34 tuần thai) tại Bệnh viện Nhân dân tỉnh Hà Nam từ tháng 1 năm 2016 đến tháng 1 năm 2019, được chỉ định là nhóm đối chứng. Tất cả những người tham gia đã ký vào bảng chấp thuận tham gia nghiên cứu. Nghiên cứu này đã được Ủy ban Đạo đức của Bệnh viện Nhân dân tỉnh Hà Nam phê duyệt.
 
RT-qPCR
Tổng RNA trong tế bào được thu nhận bằng Trizol (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) và cDNA được tổng hợp bằng cách sử dụng bộ phiên mã ngược cDNA SuperScript First Strand (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA), theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Mồi được tổng hợp bởi Sangon Biotech Co., Ltd. Các phân tích RT-qPCR được thực hiện bằng bộ kit Rotor-Gene SYBR Green PCR (Qiagen, Duesseldorf, Đức)
 
TUNEL assay
Các quy trình được thực hiện theo mô tả trong bộ xét nghiệm TUNEL-BrdU-Red (Abcam, Cambridge, Anh). Số lượng tế bào apoptosis được nhuộm huỳnh quang và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang ở độ phóng đại 200 lần.
 
Chuyển gene
HUVECs trong giai đoạn sinh trưởng logarit được cho vào các đĩa 6 giếng và chia thành các nhóm sau: blank (nuôi cấy với 10% FBS); pcDNA3.1-FN1 (nuôi cấy với 10% FBS và được chuyển gene pcDNA3.1-FN1), pcDNA3.1-NC (nuôi cấy với 10% FBS và được chuyển vector trống pcDNA3.1), đối chứng (control) (nuôi cấy với 10% huyết thanh từ phụ nữ mang thai khỏe mạnh), TSG (nuôi cấy với 10% huyết thanh từ bệnh nhân TSG), NC-siRNA (nuôi cấy với 10% huyết thanh từ bệnh nhân PE và được chuyển gene NC-siRNA), FN1-siRNA (nuôi cấy với 10% huyết thanh từ bệnh nhân TSG và được chuyển FN1-siRNA), và LY294002 (MedChemExpress, Thượng Hải, Trung Quốc) + FN1-siRNA (nuôi cấy với 10% huyết thanh từ bệnh nhân TSG và 10 μM LY294002 [chất ức chế phosphoinositide 3-kinase (PI3K)], sau đó được chuyển FN1-siRNA). Các tế bào được chuyển gene bằng cách sử dụng lipofectamine 2000 hoặc RFect siRNA (11012, Baidai, Thường Châu, Trung Quốc). RT-qPCR và Western blot được thực hiện để đánh giá nồng độ protein FN1 nhằm xác minh hiệu quả chuyển nạp sau 24 hoặc 48 giờ.
 
Phát hiện sự hình thành autophagosome với Ad-mCherry-GFP-LC3B HUVECs ở giai đoạn tăng trưởng logarit trong mỗi nhóm bị nhiễm adenovirus mCherry-green fluorescent protein-LC3B fusion protein (Ad-mCherry-GFP-LC3B) (Viện Công nghệ Beyotime, Thượng Hải, Trung Quốc). Các chấm màu vàng hoặc đỏ được quan sát dưới kính hiển vi tiêu điểm quét laser (Leica Microsystems, Wetzlar, Đức) ở độ phóng đại 1000 lần để đánh giá sự hình thành autophagosome và phát triển thành autolysosome.
 
Western blot
Tổng số protein được tách chiết từ ​​HUVECs trong mỗi nhóm theo quy trình của kit ProtoPrep® (Sigma-Aldrich, MA, USA). Nồng độ protein được đo bằng phương pháp bicinchoninic acid (Viện Công nghệ Beyotime, Thượng Hải, Trung Quốc).
 
Phân tích thống kê
Tất cả dữ liệu được phân tích với SPSS Statistics v21.0 (IBM Corp, New York, USA). Sự khác biệt giữa hai nhóm được phân tích bằng cách sử dụng bài Student’s t-test hoặc ANOVA. P <0,05 được coi là cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.
 
Kết quả
Nồng độ FN1 huyết tương ở bệnh nhân TSG
Nồng độ FN1 ở bệnh nhân trong nhóm TSG nói chung, bao gồm cả bệnh nhân MP và SP, cao hơn đáng kể so với ở bệnh nhân trong nhóm chứng (P <0,05). Ngoài ra, nồng độ FN1 ở bệnh nhân nhóm MP thấp hơn so với ở bệnh nhân nhóm SP (P <0,05), cho thấy FN1 huyết tương có thể liên quan đến bệnh sinh và mức độ nghiêm trọng của TSG.
 
Biểu hiện của FN1 trong HUVECs
Hình thái của HUVECs được quan sát dưới kính hiển vi cho thấy rằng các HUVEC trong nhóm TSG sắp xếp thưa thớt, với ranh giới kém xác định giữa nhân và tế bào chất.
 
Mức độ biểu hiện của FN1 trong HUVECs được chuyển pcDNA3.1-FN1 hoặc FN1-siRNA được phát hiện bằng RT-qPCR và Western blot cho thấy rằng mRNA của FN1 được biểu hiện quá mức trong HUVECs được chuyển pcDNA3.1-FN1. Ngoài ra, FN1 được điều chỉnh phù hợp trong HUVECs được nuôi cấy trong huyết thanh từ bệnh nhân TSG, so với ở nhóm chứng. Hơn nữa, sự biểu hiện của FN1 trong các tế bào thuộc nhóm FN1-siRNA thấp hơn đáng kể so với ở nhóm NC-siRNA, cho thấy rằng FN1-siRNA đã điều chỉnh giảm biểu hiện FN1 trong HUVECs được nuôi cấy bằng huyết thanh của bệnh nhân TSG.
 
Ảnh hưởng của việc biểu hiện quá mức và knockdown FN1 đến quá trình apoptosis của HUVECs
TUNEL assay và Western blot được sử dụng để khảo sát ảnh hưởng của FN1 đối với quá trình apoptosis ở HUVECs. Nồng độ protein liên quan đến quá trình apoptosis như caspase-9 và protein proapoptotic Bax cao hơn đáng kể, trong khi mức protein anti-apoptotic Bcl-2 thấp hơn ở nhóm pcDNA3.1-FN1 so với nhóm blank và pcDNA3.1-NC. Kết quả cho thấy sự biểu hiện quá mức của FN1 đã thúc đẩy quá trình apoptosis ở HUVECs. Ngược lại, knockdown FN1 ức chế quá trình apoptosis ở HUVECs được bổ sung huyết thanh của bệnh nhân TSG trong môi trường nuôi cấy.
 
Ảnh hưởng của việc biểu hiện quá mức và knockdown FN1 đến quá trình autophagy trong HUVECs
Bằng phương pháp Western blot nghiên cứu đánh giá nồng độ protein liên quan đến quá trình tự thực bào như LC3B, ATG5 và BECN1. So sánh với nhóm đối chứng, những protein này tăng lên ở nhóm TSG. Hơn nữa, nồng độ LC3B, ATG5 và BECN1 tăng đáng kể trong nhóm pcDNA3.1-FN1, so với trong nhóm pcDNA3.1-NC. Tuy nhiên, nồng độ những protein này giảm đáng kể trong nhóm FN1-siRNA, so với nhóm TSG và NC-siRNA. Kết quả của phương pháp phát hiện sự hình thành autophagosome với Ad-mCherry-GFP-LC3B cho thấy rằng autophagy đã được kích hoạt và xảy ra hiện tượng autophagy ở HUVECs sau khi điều trị bằng huyết thanh của bệnh nhân TSG. Những kết quả này chỉ ra rằng sự biểu hiện quá mức của FN1 đã thúc đẩy quá trình autophagy của HUVECs, nhưng việc knockdown FN1 đã ức chế quá trình autophagy của HUVECs được nuôi cấy bằng huyết thanh của bệnh nhân TSG.
 
FN1 điều chỉnh quá trình apoptosis và autophagy trong HUVECs thông qua con đường tín hiệu PI3K / AKT / mTOR
Kết quả từ phương pháp Westernblot cho thấy sự phosphoryl hóa mTOR và Akt giảm đáng kể ở nhóm TSG so với nhóm đối chứng. Hơn nữa, mức p-mTOR và p-Akt ở nhóm pcDNA3.1-FN1 thấp hơn đáng kể so với nhóm pcDNA3.1-NC. Tuy nhiên, sự phosphoryl hóa mTOR và AKT ở nhóm FN1-siRNA đã tăng lên rõ rệt so với nhóm siRNA-NC và TSG. Những kết quả này cho thấy sự biểu hiện quá mức của FN1 đã ức chế con đường tín hiệu PI3K / AKT / mTOR ở HUVECs, trong khi FN1-siRNA kích hoạt con đường tín hiệu PI3K / AKT / mTOR ở HUVECs được nuôi cấy với huyết thanh từ bệnh nhân TSG.
 
Khi bổ sung chất ức chế PI3K, LY294002, để ức chế sự hoạt hóa của con đường này trong nhóm FN1-siRNA kết quả nhận thấy quá trình apoptosis, autophagy và sự biểu hiện của các protein liên quan tăng lên. Những dữ liệu này đã chứng minh rằng LY294002 đã đảo ngược tác dụng ức chế của FN1-siRNA đối với quá trình apoptosis và autophagy trong HUVECs được nuôi cấy bằng huyết thanh của bệnh nhân TSG.
 
Kết luận
Nghiên cứu cho thấy FN1 được biểu hiện nhiều trong TSG và có thể liên quan chặt chẽ với cơ chế bệnh sinh của TSG. Các thí nghiệm in vitro cho thấy rằng FN1 thúc đẩy quá trình apoptosis và autophagy ở HUVECs bằng cách ức chế con đường tín hiệu PI3K / AKT / mTOR, có thể là cơ chế liên quan đến cơ chế sinh bệnh của TSG. Những kết quả này có thể cung cấp cơ sở lý thuyết mới cho việc nghiên cứu tổn thương và rối loạn chức năng tế bào nội mô mạch máu, với mục tiêu dài hạn là phát triển các mục tiêu mới để điều trị TSG. Tuy nhiên, mối quan hệ giữa FN1 và sự phát triển của TSG, ngoài các chi tiết về các cơ chế liên quan, cần được khám phá thêm.
  
Nguồn: Haiying Wu, Kan Liu, Jingli Zhang, Excess fibronectin 1 participates in pathogenesis of pre-eclampsia by promoting apoptosis and autophagy in vascular endothelial cells, Molecular Human Reproduction, Volume 27, Issue 6, June 2021, gaab030, https://doi.org/10.1093/molehr/gaab030

Từ khóa: Sự dư thừa Fibronectin-1 trong cơ chế bệnh sinh của biến chứng tiền sản giật thông qua thúc đẩy quá trình apoptosis và quá trình tự thực bào ở các tế bào nội mô thành mạch