STREPTOCOCCUS NHÓM B (Các phương pháp phát hiện và định danh)

Tin chuyên ngành

on Thursday 23-08-2007 7:33am

BS Đỗ Khoa Nam

1. Tính chất vi sinh học [1]:

Streptococcus nhóm B (GBS), hay còn gọi là Streptococcus agalactiae, là những vi khuẩn hình cầu hoặc hình bầu dục, đường kính trung bình 1mm, bắt màu gram dương. Vi khuẩn xếp thành chuỗi vì phân chia trong mặt phẳng thẳng góc với trục của chuỗi.

GBS có men hemolysin làm tan hoàn toàn hồng cầu nên trên môi trường thạch máu khúm vi khuẩn được bao quanh bởi một vòng nhỏ trong suốt. GBS được phân biệt với các nhóm streptococcus còn lại dựa vào các tính chất như: hình thái khúm, hiện tượng tiêu huyết, các phản ứng sinh hóa, sự đề kháng với các yếu tố vật lý và hóa học, huyết thanh học và các đặc điểm sinh thái.

2. Tính chất nuôi cấy:

Liên cầu khuẩn nhóm B là các vi khuẩn hiếu khí. Các môi trường để nuôi cấy GBS ủ 37⁰C ở không khí bình thường hoặc bình nến để có 5 - 10% CO2.

Các nghiên cứu đã được tiến hành để xác định độ nhạy và thời gian mọc của khúm GBS trong từng môi trường khác nhau như thạch máu, môi trường giàu dinh dưỡng (môi trường Columbia, môi trường Todd-Hewitt), môi trường chứa kháng sinh chọn lọc vi khuẩn và các loại môi trường chọn lọc giàu chất dinh dưỡng (môi trường selective LIM, môi trường selective Tod-Hewitt).

Các số liệu đã cho thấy môi trường chọn lọc dinh dưỡng là môi trường cấy tốt nhất vì tính nhạy cao hơn và chi phí hợp lý [3],[7],[9],[11],[12]. Các bệnh phẩm lấy từ âm đạo - trực tràng có chứa nhiều loại vi sinh vật khác nhau, nên các kháng sinh trong môi trường cấy (gentamycin và axit nalidixic, hoặc colistin và axit nalidixic) giúp loại trừ những loại vi sinh vật không phải là GBS. Chất dinh dưỡng trong môi trường cấy giúp GBS sinh sản mạnh, từ đó tăng khả năng phát hiện của phương pháp cấy lên 50% so với cách cấy trực tiếp bệnh phẩm vào môi trường thạch máu [5],[6],[8]. Do đó, các khuyến cáo đã khuyến khích sử dụng loại môi trường cấy này cho mục đích tầm soát liên cầu nhóm B [14].

Các bước tiến hành phân lập thực hiện theo khuyến cáo mới nhất của CDC, phiên bản năm 2002 về công tác dự phòng nhiễm trùng sơ sinh do GBS [14].

Ủ các ống môi trường chuyên chở có chứa bệnh phẩm ở nhiệt độ
37⁰C trong 24 giờ bên trong bình nến để có nồng độ CO2 5% - 10%.
Phân lập vi khuẩn bằng kỹ thuật cấy 3 chiều trên môi trường thạch máu ( môi trường cơ bản là môi trường Blood Agar Base của hãng Biorad có thêm 5% hồng cầu người).
Thạch máu được ủ ở 37⁰C trong 24 giờ bên trong bình nến.
Quan sát và lựa chọn các khúm nghi ngờ là Streptococcus agalactiae. Đó là các khúm nhỏ (0,5 - 1 mm), có hiện tượng tiêu huyết .

Các khúm nghi ngờ được cấy lên môi trường thạch máu một lần nữa để tăng số lượng vi khuẩn, ủ ở 37⁰C trong 24 giờ bên trong bình nến.
Lấy các vi trùng từ các khúm để tiến hành từng bước định danh xác định GBS.

3. Các phương pháp phát hiện và định danh :

Nhuộm gram: cầu khuẩn gram dương đứng riêng lẻ, từng đôi hay thành chuỗi.
Cấy khuẩn: khúm của GBS có vòng tiêu huyết nhỏ trên thạch máu.
Thử nghiệm catalase : giúp phân biệt với Staphylococci (cũng là cầu khuẩn gram dương).
Thử nghiệm CAMP: giúp phân biệt với Staphylococci.
Kết tụ (latex agglutination test - LAT) hoặc thử nghiệm huỳnh quang miễn dịch ( immunofluorescence assay ). Các xét nghiệm kháng nguyên - kháng thể [4] tuy có ưu điểm là ít tốn kém, thời gian phát hiện GBS rất nhanh (30 phút) so với các phương pháp khác nhưng không thể dùng như là một xét nghiệm để tầm soát GBS vì độ nhạy không cao, không phát hiện được những trường hợp có ít GBS trong âm đạo (light colonisation) [11].

Phản ứng ngưng kết latex

Xét nghiệm (bộ xét nghiệm Pastorex strep của hãng Biorad) này sẽ giúp định danh nhóm sau khi đã xác lập được các liên cầu khuẩn từ 2 thử nghiệm trên.

Nguyên tắc: Pastorex strep là 1 thử nghiệm ngưng kết nhanh để định nhóm liên cầu khuẩn theo phân loại của Lancefield. Thử nghiệm sử dụng huyền trọc latex chuyên biệt cho các nhóm A, B, C, D, F, G. Pastorex strep sử dụng 1 loại men để ly trích kháng nguyên nhóm. Kháng nguyên sau khi ly trích sẽ được định danh bằng cách sử dụng hạt latex có gắng kháng thể chuyên biệt nhóm. Nếu có sự hiện diện của kháng nguyên tương ứng, hạt latex sẽ ngưng kết. Nếu không có sự hiện diện của kháng nguyên tương ứng sẽ không có ngưng kết.

Tiến hành

- Cho 3 ml dung dịch men ly trích vào 1 ống nghiệm nhỏ (cho mỗi chủng liên cầu khuẩn).

- Cho 5 - 10 khúm vi khuẩn vào từng ống nghiệm.

- Khuấy hỗn hợp trong ống nghiệm cho tan đều.

- Đem ủ ống nghiệm ở 37⁰C trong 30 phút.

- Lắc đều ống chứa hạt latex rồi nhỏ 1 giọt latex lên các vòng tròn của tấm ngưng kết (agglutination card).

- Nhỏ 1 giọt dung dịch ly trích vào mỗi vòng tròn của tấm ngưng kết.

- Khuấy đều các thành phần trong mỗi vòng tròn lên.

- Lắc đều tấm ngưng kết tối đa 1 phút.

- Đọc kết quả.

Thử nghiệm tổng hợp chuỗi di truyền (fluorogenic polymerase chain reaction assay)

Một vài nghiên cứu cho thấy thử nghiệm tổng hợp chuỗi di truyền có độ nhạy (97%) và độ đặc hiệu (100%) rất cao. Hơn nữa, việc có thể thực hiện và có kết quả (30 - 45 phút) ngay lúc bắt đầu có chuyển dạ hoặc vỡ ối sẽ giúp cho công tác điều trị chính xác và kịp thời. Tuy nhiên, do chi phí của thử nghiệm và các trang thiết bị rất tốn kém nên thử nghiệm này có thể sẽ là một phương pháp tầm soát trong tương lai [2],[10].

Preference

1. Nguyễn Thanh Bảo (1997), "Cầu khuẩn gram dương Streptococci", Vi khuẩn học, tr. 97 - 105.

2. Bergeron MG, Ke D, Menard C, et al (2000), "Rapid detection of group B streptococci in pregnant women at delivery", N Engl J Med; 343:175--9.

3. Bosch J, Murillo S, Rico M, Salgado M (1998), "The usefulness of a selective disk-broth media for the detection of group B streptococci in the vagina", Enferm Infecc Microbiol Clin;16(2):83-4.

4. Carroll KC, Ballou D, Varner M, Chun H, Traver R, Salyer J (1996), "Rapid detection of group B streptococcal colonization of the genital tract by a commercial optical immunoassay", Eur J Clin Microbiol Infect Dis;15(3):206-210.

5. CDC (1999), "Laboratory practices for prenatal GBS screening and reporting. Connecticute, Georgia and Minnesota, 1997 - 1998", MMWR; 48:426-8.

6. Clad, H. -M. Runge (2005), "Module 8 : Infections in pregnancy and childbirth", Postgaduate training and research in reproductive health

7. Elsayed S, Gregson DB, Church DL (2003), "Comparison of direct selective versus nonselective agar media plus LIM broth enrichment for determination of group B streptococcus colonization status in pregnant women", Arch Pathol Lab Med;127(6):718-20.

8. Ferrieri P, Blair LL (1977), "Pharyngeal carriage of group B streptococci: detection by three methods", J Clin Microbiol; 6:136-9.

9. Gupta C, Briski LE (2004), "Comparison of two culture media and three sampling techniques for sensitive and rapid screening of vaginal colonization by group B streptococcus in pregnant women", J Clin Microbiol;42(9):3975-7.

10. Ke D, Menard C, Picard FJ, Boissinot M, Ouellette M, Roy PH, Bergeron MG (2000), "Development of conventional and real-time PCR assays for the rapid detection of group B streptococci", Clin Chem, 46(3):324-31.

11. Nguyen TM, Gauthier DW, Myles TD, Nuwayhid BS, Viana MA, Schreckenberger PC (1998), "Detection of group B streptococcus: comparison of an optical immunoassay with direct plating and broth-enhanced culture methods", J Matern Fetal Med, 7(4):172-6.

12. Rauen NC, Wesenberg EM, Cartwright CP (2005), "Comparison of selective and nonselective enrichment broth media for the detection of vaginal and anorectal colonization with group B streptococcus", Diagn Microbiol Infect Dis, 51(1):9-12.

13. Samadi R, Stek A, Greenspoon JS (2001), "Evaluation of a rapid optical immunoassay-based test for group B streptococcus colonization in intrapartum patients", J Matern Fetal Med, 10(3):203-8.

14. Stephanie Schrag, Phil, Rachel Gorwitz, Kristi Fultz-Butts, Anne Schuchat, (2002), "Prevention of perinatal group B streptococcal disease", Revised guidelines from CDC.