ThS. Lê Thị Bích Phượng - Chuyên viên phôi học - IVFMD Phú Nhuận

 Được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1970, kỹ thuật đông lạnh tinh trùng ngày càng trở nên quan trọng trong hỗ trợ sinh sản và đã được thực hiện phổ biến trên toàn thế giới. Nguyên tắc chung của kỹ thuật đông lạnh tinh trùng là giảm nhiệt độ của môi trường chứa tinh trùng xuống nhiệt độ rất thấp (-196^oC) để làm tạm ngưng các quá trình sinh hóa diễn ra trong tế bào tinh trùng. Ở nhiệt độ -196^oC, hầu hết các hoạt động sinh học bên trong tế bào bao gồm các phản ứng sinh hóa và hoạt động trao đổi chất đều dừng lại. Nhờ đó tế bào sống ở dạng tiềm sinh và có thể bảo quản trong thời gian rất dài. Những trường hợp được chỉ định đông lạnh tinh trùng khi thực hiện hỗ trợ sinh sản bao gồm người hiến tặng cho ngân hàng tinh trùng, tích luỹ tinh trùng cho những trường hợp có ít tinh trùng trong tinh dịch, bảo tồn khả năng sinh sản cho những bệnh nhân điều trị ung thư, những trường hợp thu nhận tinh trùng từ thủ thuật hoặc đối với nam giới gặp khó khăn trong quá trình xuất tinh. Tuy nhiên, đã có nhiều báo cáo cho rằng kỹ thuật đông lạnh có tác động tiêu cực lên chất lượng tinh trùng. Trong báo cáo của Honda và cộng sự (2001), nhóm tác giả cho thấy đông lạnh không ngăn chặn được quá trình lão hoá của tinh trùng do quan sát thấy hiện tượng rút ngắn telomere cũng như sự cảm ứng lão hoá của tế bào.

Sự thay đổi của tinh trùng trong quá trình đông lạnh
Màng bào tương tinh trùng đóng một vai trò quan trọng trong suốt quá trình đông lạnh và rã đông vì sự sống sót của tinh trùng sau đông lạnh phụ thuộc nhiều vào sự nguyên vẹn của màng bào tương. Màng bào tương của tinh trùng được tạo thành từ lớp đôi phospholipid kết hợp với protein, carbohydrate xuyên màng và các acid béo giúp màng ở trạng thái lỏng, đảm bảo phản ứng tốt hơn với quá trình đông lạnh. Bên cạnh trạng thái lỏng, tính thấm của màng đóng vai trò quan trọng không kém. Tính thấm của màng bào tương sẽ giảm liên tục trong giai đoạn đông lạnh và trở nên không thấm, giúp toàn bộ các chất lỏng được giữ lại trong tế bào chất dễ kết tinh. Trong quá trình đông lạnh, tốc độ đông lạnh là yếu tố quyết định sự thành công của một quy trình đông lạnh- rã đông. Quá trình giảm nhiệt độ từ 37^oC xuống 0^oC làm thay đổi màng phospholipid từ trạng thái lỏng sang dạng gel. Vì sự thay đổi pha diễn ra không đồng thời trên màng bào tương làm giảm sự sắp xếp của lớp phospholipid và làm tăng tính thấm của màng tế bào đối với các chất hoà tan, việc sử dụng các chất bảo vệ đông lạnh kèm tốc độ đông lạnh hợp lý giúp giảm thiểu tác hại lên tinh trùng trong bước đông lạnh đầu tiên. Nhiệt độ giảm xuống 0^oC thúc đẩy quá trình hình thành tinh thể đá nội bào. Do đó, phải giảm thiểu hàm lượng nước bên trong tinh trùng, tránh hình thành các tinh thể đá có thể gây tổn thương cho các bào quan và màng tế bào. Song song với quá trình giảm nhiệt độ, người ta quan sát thấy có sự xuất hiện của dòng canxi hướng vào tế bào chất của tinh trùng. Trong trường hợp này, phospholipid hiện diện trong các chất bảo vệ đông lạnh giúp màng chống lại sự sốc canxi và cân bằng được nồng độ canxi để tinh trùng có thể phục hồi tốt sau rã đông.

Những tổn thương liên quan đến quá trình đông lạnh không chỉ làm thay đổi cấu trúc màng tinh trùng mà còn tác động đến quá trình trao đổi chất và chuyển hoá năng lượng sinh học của ti thể. Người ta quan sát rằng có sự phân huỷ protein cũng như quá trình phosphoryl hoá được báo cáo trong mẫu tinh trùng sau rã đông. Ngoài ra, vài báo cáo còn chỉ ra rằng khả năng sinh sản của tinh trùng sau đông lạnh cũng bị giảm đáng kể do quá trình lão hoá từ đó làm giảm khả năng sinh sản của tinh trùng, giảm số lượng tinh trùng di động và tinh trùng sống. Ngoài ra những tổn thương về ti thể, hình thái và tính toàn vẹn của DNA tinh trùng cũng đã được báo cáo. Phần tiếp theo sẽ trình bày về một số tác động của kỹ thuật đông lạnh lên chất lượng tinh trùng.

Hình dạng tinh trùng
Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng hình dạng tinh trùng giảm đáng kể sau rã đông. Khi đánh giá trên quy trình đông lạnh chậm, người ta cho rằng sốc thẩm thấu gây ra bởi các chất bảo vệ đông lạnh là lý do làm thay đổi hình dạng của tinh trùng trong mẫu rã đông. Trong quy trình thuỷ tinh hoá, sự suy giảm hình thái bình thường có liên quan đến sự hình thành tinh thể đá ngoại bào. Tuy nhiên hình dạng tinh trùng thay đổi không có tác động rõ ràng lên kết quả sinh sản.

Tính toàn vẹn DNA tinh trùng
Những thay đổi về tính toàn vẹn DNA tinh trùng liên quan đến kỹ thuật đông lạnh chủ yếu thông qua hai quá trình: apoptosis và stress oxy hoá gây ra bởi các tác nhân oxy hoá (reactive oxygen species – ROS). Theo Thomson và cộng sự (2009), ROS sản sinh trong quá trình đông lạnh có thể là nguyên nhân chính gây tổn hại đến DNA tinh trùng. Trong báo cáo của Meseguer và cộng sự (2004), glutathione-peroxidase ở nồng độ cao có thể là dấu hiệu sinh học cho một quy trình đông lạnh- rã đông tinh trùng thành công vì phức hợp này có khả năng loại bỏ các gốc tự do gây hại cho DNA. Bên cạnh đó, các thành phần khác trong môi trường đông lạnh như các enzym chống oxy hoá, albumin cũng được chứng minh là có vai trò ngăn chặn việc giải phóng ROS và ức chế hoạt động của chúng.

Tuy nhiên, tác động của đông lạnh lên tính toàn vẹn của DNA tinh trùng vẫn còn gây tranh cãi. Trong báo cáo của Ribas-Maynou và cộng sự (2014), nhóm tác giả đã báo cáo rằng có sự tăng nhẹ các tổn thương trên mạch đơn DNA tinh trùng ở mẫu đông lạnh nhưng không có tác động nào lên DNA mạch đôi. Điều này đặc biệt quan trọng vì các tổn thương trên DNA khác nhau sẽ cho kết quả lâm sàng khác nhau. Các đứt gãy mạch đôi DNA làm tăng nguy cơ sẩy thai trong khi đứt gãy ở mạch đơn DNA không có tác động lâm sàng nào khác ngoài giảm tỉ lệ thụ tinh. Vẫn chưa có nghiên cứu nào tìm thấy được sự khác biệt về sai hỏng DNA tinh trùng ở các phương pháp đông lạnh khác nhau. Vài báo cáo cho thấy mức độ toàn vẹn của DNA tinh trùng chiếm đến 70% mẫu sau khi đông lạnh. Nhưng một số báo cáo khác lại cho rằng chỉ có 15% tinh trùng giữ được tính toàn vẹn DNA ở mẫu sau đông lạnh.

Sự trưởng thành của tinh trùng
Các nghiên cứu đã báo cáo rằng có sự xuất hiện của protein liên kết với acid hyaluronic trên màng của tinh trùng trưởng thành. Các protein này có liên quan đến hoạt động sinh lý của tinh trùng như phản ứng cực đầu. Trong nghiên cứu của Yogev và cộng sự (2010), tình trạng trưởng thành của tinh trùng được báo cáo như là dấu hiệu thành công của một chu kỳ đông lạnh- rã đông tinh trùng. Tác giả này cho rằng có mối tương quan yếu giữa khả năng gắn kết với acid hyaluronic của tinh trùng với tỉ lệ sống trong mẫu rã đông. Tuy nhiên một số nghiên cứu khác cho rằng các vị trí liên kết với acid hyaluronic trong tinh trùng không bị thay đổi khi đông lạnh, do đó, khả năng liên kết với acid hyaluronic sẽ không phải là một dấu hiệu hữu ích để đánh giá kết quả đông lạnh.
Khả năng sống của tinh trùng

Khả năng sống sót của tinh trùng được xem là thông số chính khi đánh giá về kết quả của một kỹ thuật đông lạnh. Sự sống của tinh trùng được đánh giá thông qua tính toàn vẹn của màng tế bào tinh trùng. Hiện nay, các xét nghiệm đánh giá khả năng sống của tinh trùng dựa trên tính toàn vẹn của màng bào tương tinh trùng chủ yếu là nhuộm eosin và sử dụng môi trường nhược trương (HOS- test). Hai phương pháp này có thể giúp đánh giá được những tinh trùng sống nhưng không di dộng. Tuy nhiên, vẫn có một số mặt hạn chế nhất định khi thực hiện hai phương pháp này. Trong phương pháp nhuộm Eosin, không thể thu nhận những tinh trùng sau nhuộm để thực hiện thụ tinh. Trong kỹ thuật HOS-test, tinh trùng vẫn có thể được sử dụng để ICSI. Tuy nhiên một số nghiên cứu đã báo cáo rằng hiện tượng phồng và cong đuôi của tinh trùng trong kỹ thuật này có thể xảy ra tự phát, dẫn đến một số tinh trùng đã chết vẫn có thể căng phồng và cong đuôi. Đặc biệt, hiện tượng tự cong đuôi diễn ra phổ biến ở những mẫu tinh trùng rã đông.

Tinh trùng di động được nhờ vào việc sử dụng năng lượng ATP tạo ra từ ti thể. Một số nghiên cứu cho thấy tốc độ di chuyển của tinh trùng giảm đáng kể trong mẫu rã đông và điều này được báo cáo là do việc giảm hoạt tính và chức năng của ti thể sau quy trình đông lạnh. Thông qua điều này, khả năng di chuyển của tinh trùng có thể được sử dụng như thông số đánh giá về khả năng sống của tinh trùng sau rã đông. Tổng số tinh trùng di động trong mẫu có thể được xem như thông số đánh giá kết quả của một kỹ thuật đông lạnh.

Tổng số tinh trùng di động
Tổng số tinh trùng di động được tính dựa trên tỉ lệ tinh trùng di động và mật độ tinh trùng, được xem là thông số hữu ích khi đánh giá mẫu tinh trùng sau đông lạnh. Các nghiên cứu gần đây cho rằng tổng số tinh tùng di động có vai trò quan trọng trong chu kỳ ICSI của những bệnh nhân ung thư tinh hoàn, OAT nặng. Hotaling và cộng sự (2016) đã báo cáo rằng tổng số tinh trùng di động cao trong mẫu rã đông là yếu tố tiên lượng tốt cho kết quả điều trị ICSI của bệnh nhân ung thư tinh hoàn. Tương tự, nghiên cứu của Borges và cộng sự (2016), Palomar và cộng sự (2018) cho thấy tổng số tinh trùng di động được sử dụng để ước tính chính xác số lượng tinh trùng sống sót sau rã đông và được sử dụng cho việc tiên lượng kết quả điều trị ICSI.

Kết luận
Như vậy, đông lạnh là một kỹ thuật có thể tác động lên chất lượng tinh trùng. Cho đến nay, các tác động của kỹ thuật đông lạnh tinh trùng lên các thông số như hình thái, tính toàn vẹn của DNA tinh trùng, khả năng di động, khả năng sống của tinh trùng vẫn còn gây tranh cãi. Phát triển kỹ thuật đông lạnh ít gây tác động lên chất lượng tinh trùng cũng như kết quả điều trị của bệnh nhân IVF đang là hướng tiếp cận của nhiều nhóm nghiên cứu trên toàn thế giới. Hiện nay, một số phương pháp mới như đông lạnh tinh trùng số lượng ít, đông lạnh tinh trùng không sử dụng chất bảo vệ đông lạnh, bổ sung thêm các chất chống oxy hoá vào môi trường đông lạnh đang được nghiên cứu và trên đà phát triển. Hy vọng trong thời gian tới, những kỹ thuật này sẽ được sử dụng phổ biến để hạn chế những tác động bất lợi của kỹ thuật đông lạnh lên chất lượng tinh trùng.
  
Lược dịch từ: Rios A, Botella I. Reproductive Health : Causes and Impact of Cryopreservation-Associated Damage on Different Parameters of Human Spermatozoa and its Clinical Impact - European Medical Journal. Eur Med J 2019:100–9.

Từ khóa: Tác động của phương pháp đông lạnh - rã đông lên chất lượng tinh trùng