BS. Vũ Đình Tuân và cs

Bệnh viện Hùng Vương

ĐẶT VẤN ĐỀ

Điều trị hiếm muộn bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều thập kỷ qua trên thế giới. Phác đồ điều trị ngày càng hiệu quả hơn với số lượng nang noãn vừa phải và chất lượng nang tối ưu. Tỉ lệ thụ tinh cao, chất lượng phôi tốt đạt được nhiều và đặc biệt là hệ thống nuôi cấy phôi ngày càng hoàn thiện đã cho phép một số trung tâm nuôi cấy phôi tiếp đến ngày 5, thậm chí ngày 6^[6]. Phôi ở giai đoạn này được gọi là phôi nang. Tỉ lệ phôi phát triển tiếp đến giai đoạn phôi nang đạt gần 66% với tỉ lệ làm tổ trên 50%^[5,6].

Ứng dụng hệ thống nuôi cấy phôi nang, bệnh nhân đạt được những kết quả như:

- Phôi được lựa chọn có khả năng làm tổ cao.

- Chuyển ít phôi nên hạn chế khả năng đa thai.

- Tỉ lệ trẻ sinh sống từ chuyển phôi nang cao hơn 1,35 lần so với chuyển phôi ở giai đoạn phôi sớm.

Nhưng bên cạnh đó, bệnh nhân phải chấp nhận số phôi dư trữ đông ít vì một tỉ lệ khá cao số phôi không thể tiếp tục phát triển đến giai đoạn phôi nang.

Nghiên cứu của chúng tôi đặt ra vấn đề ở đây là liệu có mối tương quan nào giữa chất lượng phôi phân chia (ngày 3) đến sự phát triển tiếp theo giai đoạn phôi nang (ngày 5). Nếu như chúng ta có thể xác định được mối tương quan này sẽ giúp hạn chế việc chọn nhầm những phôi không có khả năng nuôi cấy tiếp. Từ đó, có thể nâng tỉ lệ phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang lên đến 80%, thay vì chỉ khoảng 60% như hiện nay.

Để lựa chọn chính xác phôi nuôi cấy tiếp đến giai đoạn phôi nang, cần căn cứ vào rất nhiều yếu tố và tiêu chí như: số lượng tế bào, mức độ phân mảnh, sự xuất hiện sớm giai đoạn nén của phôi vào ngày 3, độ đồng đều của phôi bào, độ mịn của bào tương, thời điểm đánh giá phôi, đặc điểm phân mảnh bào tương (phân mảnh tập trung, phân mảnh rời rạc), trạng thái nhân của mỗi phôi bào, sự phân bố về mặt không gian của phôi bào, mức độ nén của phôi bào... Nhưng do hạn chế về thời gian đầu triển khai, nên chúng tôi chỉ mới tập trung căn cứ vào các đặc điểm đánh giá chất lượng phôi ngày 3 và ngày 5 dựa theo đồng thuận Alpha, từ đó xác định mối tương quan giữa hai nhóm phôi này để có những số liệu cơ bản trong việc lựa chọn phôi sao cho đạt hiệu quả tối ưu nhất.

MỤC TIÊU

Phân tích mối tương quan giữa chất lượng phôi ngày 3 và sự hình thành phôi ngày 5. Từ đó xác định một số đặc điểm để lựa chọn phôi ngày 3 sao cho đạt hiệu quả phôi phát triển tối ưu nhất vào ngày 5.

TỔNG QUAN Y VĂN

Một số đặc điểm về hệ thống nuôi cấy phôi nang

Nguồn năng lượng

Trứng ở giai đoạn tiền nhân, tương tự như trứng ở giai đoạn MII, tiêu thụ lượng oxygen khá ít và đặc biệt đòi hỏi carboxylic acid (ví dụ như pyruvate) là nguồn cung cấp năng lượng chủ yếu. Ở giai đoạn phôi phân chia sớm, glucose được sử dụng với lượng rất nhỏ (các hoạt động sinh tổng hợp của phôi ít xảy ra ở những giai đoạn đầu).

Ở giai đoạn phôi nang, phôi có nhu cầu sử dụng nhiều oxygen hơn và liên tục sử dụng glucose cùng các nguồn cung cấp năng lượng khác.

Dịch bên trong vòi trứng có nồng độ cao pyruvate (0,32 mmol/l) và lactate (10,5 mmol/l), đồng thời nồng độ thấp glucose (0,5 mmol/l). Ngược lại, dịch bên trong buồng tử cung lại có nồng độ thấp pyruvate (0,1 mmol/l) và lactate (5,87 mmol/l), đồng thời nồng độ glucose cao (3,15 mmol/l).

Amino acid

Sau giai đoạn compact, các amino acid không thiết yếu và glutamin làm tăng sự hình thành blastocoel (khoang phôi) và tăng sự thoát màng, trong khi các amino acid thiết yếu kích thích tốc độ phân chia và sự phát triển của ICM trong blastocyst.

Tỉ lệ làm tổ của phôi blastocyst được cải thiện khi trứng giai đoạn tiền nhân được nuôi cấy với các amino acid không thiết yếu đến giai đoạn 8 tế bào, sau đó tiếp tục nuôi cấy với đủ 20 loại amino acid từ giai đoạn 8 tế bào đến giai đoạn blastocyst.

Mặc dù các amino acid được phôi sử dụng, nhưng việc nó được phân hủy liên tục tạo nên lượng lớn ammonium được sản sinh trong môi trường nuôi cấy. Ammonium được tạo ra trong môi trường nuôi cấy không những có ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của phôi trong môi trường mà còn ảnh hưởng việc phát triển bình thường của thai ở nồng độ khoảng 300 µmol/l. Hơn nữa, ammonium đã được chứng minh có ảnh hưởng đến sự trao đổi chất, độ pH, sự điều hòa và sự biểu hiện gen của phôi. Cách giải quyết tốt nhất là thay đổi môi trường nuôi cấy nhằm kiểm soát nồng độ ammonium.

Oxygen

Sự thật là phôi người có thể phát triển ở nồng độ oxygen trong không khí (khoảng 20%). Nồng độ oxygen trong buồng tử cung thấp hơn nhiều so với trong vòi trứng. Người ta chứng minh rằng phôi động vật hữu nhũ phát triển tốt nhất ở nồng độ oxygen dưới 10%. Hơn nữa, nhiều nghiên cứu cho thấy phôi được nuôi cấy đến giai đoạn blastocyst ở nồng độ 20% bị biến đổi sự biểu hiện gen. Ngược lại, khi được nuôi cấy ở nồng độ oxygen khoảng 5% phôi ít bị ảnh hưởng đến sự biểu hiện của cả gene và proteome. Ngoài ra, có nghiên cứu cho thấy những phôi được nuôi cấy trong môi trường oxygen thấp sẽ tạo ra phôi nang với số tế bào nhiều hơn đáng kể so với những phôi được nuôi cấy trong môi trường oxygen cao (20%).

Tủ nuôi cấy

Điểm mấu chốt để nuôi cấy phôi thành công là giảm thiểu việc làm nhiễu không khí chung quanh phôi. Hai vấn đề cần lưu ý tránh gây nhiễu là sự thay đổi pH và nhiệt độ.

Phôi phải được duy trì trong khoảng cho phép khi được nuôi cấy ở pH 7,4. Mặc dù các hệ thống môi trường được khuyến cáo sử dụng ở pH 7,2 đến 7,4, tốt hơn chúng ta cần đảm bảo pH không vượt quá 7,4. Vì vậy, nồng độ CO₂ được khuyên nên đảm bảo ở khoảng 6% và 7% để đạt pH môi trường trong khoảng 7,3.

Đánh giá phôi ngày 3 (theo đồng thuận Alpha)

Đánh giá phôi ngày 5

Định nghĩa phôi ngày 5 (phôi nang)

Là phôi phát triển đến giai đoạn bao gồm 2 thành phần tế bào khác nhau và một khoang phôi chứa dịch.

Phôi người được nuôi cấy trong điều kiện lab, hoặc phát triển tự nhiên trong cơ thể, thường đạt đến giai đoạn phôi nang 5 ngày sau khi thụ tinh.

Sự phát triển của phôi blastocyst và các tiêu chí đánh giá

Phôi được chấm điểm cho cả 3 tiêu chí nói trên và điểm được biểu hiện thành ký hiệu gồm 1 số và 2 ký tự theo thứ tự độ giãn nở, chất lượng ICM và chất lượng TE (4AA hoặc 3AB). Một số trung tâm còn có thể chia thành các thang đánh giá D hoặc thậm chí E cho các phôi có chất lượng xấu hơn.

Early blastocyst	Early blastocyst	1AB
2BB	2BC	3BB
4AA	4AB	4BB
5AA	6AA

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Phương pháp: mô tả cắt ngang.

- Đối tượng: tất cả những ca thực hiện IVF vào ngày chọc hút trứng, số lượng trứng thu nhận được từ 10 trứng trở lên, tuổi người vợ (hoặc Donor) dưới 40 tuổi, đồng ý tham gia thực hiện và có ít nhất 4 phôi tốt vào ngày 3.

- Tiêu chuẩn loại trừ: không đạt những tiêu chuẩn trên hoặc không đồng ý tham gia.

- Thời gian: từ ngày 01/01/2012 đến 30/09/2012.

* Tiến hành

- Làm các bước tương tự qui trình chọc hút trứng (bắt đầu lúc 8 giờ sáng), ICSI 4-5 giờ sau và nuôi cấy trứng sau chích ICSI.

- Chuẩn bị đĩa cấy (từ ngày 3 đến ngày 5): Vào sáng ngày 3 (68 ± 1 giờ), tiến hành kiểm tra phôi và quyết định chuyển phôi hoặc nuôi cấy tiếp đến blastocyst. Đối với những ca nuôi cấy tiếp đến blastocyst, chúng tôi chia đều 2 nhóm, nửa số phôi hữu dụng được đông vào ngày 3, phân nửa còn lại sẽ được nuôi cấy tiếp, tiến hành tạo đĩa cấy với môi trường G2 plus (hệ thống giọt nuôi cấy nhỏ có phủ dầu). Sau khi để đĩa môi trường trong tủ ủ tối thiểu 2 tiếng cho cân bằng trước khi được sử dụng cho việc nuôi cấy phôi, tiến hành chuyển phôi từ môi trường G1 plus sang môi trường G2 plus.

- Vào sáng ngày 5 (116 ± 1 giờ), tiến hành đánh giá phôi và quyết định số lượng phôi chuyển và phôi đông (nếu có).

- Đối với những phôi không/chưa phát triển thành blastocyst, chúng tôi tiến hành chuyển phôi vào đĩa môi trường G2 plus mới nuôi tiếp đến ngày 6 và tiến hành đánh giá vào sáng ngày 6 (vẫn có thể tiến hành chuyển hoặc đông phôi vào ngày này nếu có phôi blastocyst).

KẾT QUẢ

Bảng 1. Đặc điểm bệnh nhân

Bảng 2. Kết quả nuôi cấy ngày 5

Bảng 3. Kết quả có thai chuyển phôi ngày 5

Bảng 4. So sánh tương quan giữa chất lượng phôi ngày 3 và phôi ngày 5

BÀN LUẬN

Vấn đề nuôi cấy phôi đến ngày 5 đã và đang thực hiện ở rất nhiều trung tâm trên thế giới. Trung tâm chúng tôi đã bắt đầu triển khai từ quý IV năm 2011 và hiện đang dần đi vào ổn định về tỉ lệ có phôi blastocyst hình thành vào ngày 5 (58,7%) tương đương với hầu hết các trung tâm khác và có sự khác biệt nếu nuôi cấy phôi tiếp tục đến ngày 6 (67,9%; p=0,008). Nhằm cải thiện hơn nữa hiệu quả chọn lựa phôi ngày 3 sao cho phôi đi đến được giai đoạn phôi ngày 5 với tỉ lệ tối ưu nhất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu mối tương quan giữa chất lượng phôi ngày 3 và sự hình thành phôi ngày 5. Việc đánh giá chất lượng phôi dựa theo đồng thuận Alpha vừa ban hành, để có một số liệu khách quan và thống nhất với các trung tâm khác. Ban đầu chúng tôi đánh giá mối tương quan giữa các nhóm phôi tốt, trung bình, xấu của ngày 3 và sự hình thành phôi tốt, trung bình và xấu khi đến ngày 5. Bảng 4 cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nhóm phôi tốt, trung bình và xấu từ ngày 3 đạt được phôi tốt vào ngày 5, nhưng không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa nhóm phôi tốt so sánh với nhóm phôi trung bình từ ngày 3 đạt được phôi trung bình vào ngày 5. Còn nhóm phôi xấu ngày 3, khả năng đạt được phôi tốt và trung bình vào ngày 5 là rất thấp và khác biệt có ý nghĩa so với hai nhóm phôi còn lại. Như vậy, nên chăng khi chọn lựa phôi để nuôi cấy tiếp, ưu tiên lựa chọn những phôi tốt và trung bình để có khả năng phôi phát triển tiếp tục? Tuy nhiên, với một tỉ lệ #24% số phôi xấu đạt đến giai đoạn phôi ngày 5, chúng ta không nên bỏ hẳn những phôi xấu mà nên tiếp tục nuôi cấy để tăng thêm số lượng phôi cho bệnh nhân.

Chúng tôi cũng thống kê tỉ lệ có thai khi chuyển phôi tươi và chuyển phôi đông, điều đáng ngạc nhiên là tỉ lệ có thai khi chuyển phôi đông cao hơn chuyển phôi tươi, điều này cũng phù hơp với một nghiên cứu mới đây của tác giả Bruce và cộng sự (năm 2011), nhưng do số liệu của chúng tôi còn thấp nên cần có thời gian để đưa ra một kết luận chính xác.

Như trên đã trình bày, việc nuôi cấy phôi tiếp tục đến ngày 6 cho thấy có sự khác biệt về số phôi blastocyst hữu dụng cho chuyển hoặc đông phôi. Đây là một kết quả thống kê chúng tôi nhận thấy khi thực hiện. Do vậy, có nên chăng nuôi cấy tiếp và chuyển phôi ngày 6 nếu như chưa có phôi hữu dụng vào ngày 5?

KẾT LUẬN

Việc nuôi cấy phôi đến ngày 5 là phương pháp lựa chọn những phôi tốt nhất để chuyển cho bệnh nhân, nhằm nâng cao hơn nữa tỉ lệ có thai, giảm số phôi chuyển giúp giảm tỉ lệ đa thai cho bệnh nhân. Lựa chọn những phôi phù hợp vào ngày 3 sẽ giúp tăng tỉ lệ số phôi đạt được đến ngày 5 và nếu tiếp tục nuôi cấy đến ngày 6 sẽ giúp tăng hơn nữa tỉ lệ thành công cho việc nuôi cấy phôi đến giai đoạn blastocyst.

Tài liệu tham khảo

1. IVF Blastocyst Pictures & Blastocyst Stage Embryo Grading Photos & Images. www.advancedfertility.com/blastocystimages.

3. Bruce S. Shapiro, M.D., Ph.D and al. Evidence of impaired endometrial receptivity after ovarian stimulation for in vitro fertilization: a prospective randomized trial comparing fresh and frozen–thawed embryo transfer in normal responders. Fertility and Sterility Vol. 96, No. 2, August 2011.

4. David K.Gardner and Michelle Lane. Culture of viable human blastocyst in defined sequential serum-free media. European Society for Human Reproduction and Embryology Human Reproduction Volume 13, Supplement 3, 1998.

5. Gardner DK, Surrey E, Minjarrez D, Leitz A, Stevens J, Schoolcraft WB. Single blastocyst transfer: a prospective randomized trial. Fertil Steril 2004, 81:551-555.

6. Glujovsky D, Blake D, Farquhar C, Bardach A. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database Syst Rev. 2012 Jul 11; 7:CD002118.