Vũ Đình Tuân

Bệnh viện Hùng Vương

Giới Thiệu

Phương pháp nuôi cấy phôi thai người hiện nay phần lớn vẫn không thay đổi từ kỹ thuật đầu tiên đã được phát triển khoảng 50 năm trước đây. Bước sang thập kỷ II của thế kỷ 21, chúng ta tiếp cận một cuộc cách mạng về kỹ thuật nuôi cấy phôi, và điều này là hợp lý để đề xuất các phương pháp và thiết bị sẽ được sử dụng cho nuôi cấy phôi ở cuối thập kỷ này, nhằm cải tiến nhiều hơn nữa so với phương pháp hiện tại. Ngày nay, với những tiến bộ không ngừng về kỹ thuật mới, nhiều nghiên cứu cho thấy việc chuyển phôi ở giai đoạn phôi nang giúp tăng tỉ lệ có thai so với chuyển phôi ở giai đoạn phôi phân chia và có thể áp dụng kỹ thuật chẩn đoán di truyền tiền làm tổ (PGD) để lựa chọn những phôi có chất lượng tốt nhất chuyển vào cơ thể của người phụ nữ. Điều này sẽ không thể thực hiện nếu không có một hệ thống nuôi cấy phôi ổn định, đạt hiệu quả cao. Một số nghiên cứu cho thấy đa thai làm tăng nguy cơ sinh non, sinh nhẹ cân ở sản phụ và có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của trẻ sau này. Đó chính là động lực để cải thiện điều kiện nuôi cấy, kết hợp với những tiến bộ trong sự hiểu biết về sinh học của phôi giai đoạn tiền làm tổ và giới thiệu công nghệ nano, sẽ đưa ra nhiều thay đổi trong công nghệ nuôi cấy. Một đánh giá kỹ lưỡng hơn về sinh lý tế bào của phôi trong suốt thời gian tiền làm tổ sẽ cho phép các nhà phôi học theo dõi sinh lý phôi và điều chỉnh điều kiện nuôi cấy để đảm bảo rằng phôi duy trì cân bằng nội môi với năng lượng tối thiểu. Một sự hiểu biết chi tiết về sinh lý học phôi cũng sẽ được sử dụng để phát triển các bài kiểm tra để đánh giá sức khỏe của phôi. Đổi lại, việc giới thiệu thử nghiệm mới sẽ ảnh hưởng đến nuôi cấy phôi như thế nào? Nhanh chóng thúc đẩy lĩnh vực công nghệ nano cũng sẽ cung cấp nhiều công cụ mới cho các thao tác, nuôi cấy và đánh giá phôi.

Đây là thời kỳ chuyển mình trong phôi học: rõ ràng rằng sự thay đổi sắp xảy ra và cần thiết nhưng sẽ gặp khá nhiều khó khăn và thách thức. Khi chúng ta xem xét tương lai của phương pháp nuôi cấy phôi, trước tiên chúng ta cần xem xét các thông số quan trọng cho nuôi cấy phôi và phân tích, sau đó đánh giá hệ thống nuôi cấy chuẩn hiện nay như thế nào, giải quyết những vấn đề này và cuối cùng nhìn về tương lai hệ thống nuôi cấy phôi. Việc xây dựng hệ thống nuôi cấy phôi ổn định và hiệu quả sẽ góp phần tạo ra những phôi có chất lượng tốt, khả năng làm tổ cao, giảm số phôi chuyển và từ đó giúp gia tăng tỉ lệ thành công của IVF.

Những gì một phôi cần?

Trong dự tính tương lai, một trong những nguyên tắc cơ bản cho hệ thống nuôi cấy phôi là tạo điều kiện thúc đẩy sự phát triển tối ưu cho cả giai đoạn phôi nang và đạt tỉ lệ mang thai tối đa. Những lợi thế của nuôi cấy phôi đến giai đoạn phôi nang đã được công nhận. Ngày nay, việc đánh giá sự phát triển phôi tiền làm tổ dựa theo các tiêu chí hình thái là một yếu tố dự báo nghèo tiềm năng phát triển, và sự diễn tiến thành một phôi blastocyst bình thường cũng chưa chắc đảm bảo phôi đó có tiềm năng phát triển tối ưu. Nhiều sự chú ý liên quan đến điều kiện nuôi cấy phôi trong vài thập kỷ qua đã tập trung vào các môi trường nuôi cấy. Chúng có các chức năng quan trọng như: tác dụng thủy hóa, cung cấp các ion, các chất dinh dưỡng và pha loãng chất thải. Ở một mức tối thiểu, phôi yêu cầu một phức hợp các chất điện giải, năng lượng, acid amin, vitamin và oxy cho sự phát triển thích hợp trong ống nghiệm. Một đại phân tử như albumin huyết thanh còn đóng vai trò như một chất làm sạch các tạp chất, hoạt hóa bề mặt, có vai trò dinh dưỡng, ngoài ra còn giúp ngăn cản các giao tử hay phôi dính vào thủy tinh hay plastic khiến thao tác dễ dàng hơn. Ngoài ra, một đại phân tử khác là glucosaminoglycan hyaluronan có vai trò quan trọng trong việc nuôi cấy phôi, bổ sung hyaluronan vào môi trường nuôi cấy vừa có chứa albumin làm gia tăng đáng kể sự phát triển, nâng cao được sự sống sót của phôi sau trữ-rã đông, tăng tỉ lệ làm tổ và mang thai. Để đáp ứng với những phôi thai thay đổi nhu cầu và để bắt chước giống với chất dinh dưỡng của đường sinh sản người nữ, hai giai đoạn khác nhau của hệ thống nuôi đã được phát triển với mục đích sử dụng khác nhau dành cho trước và sau khi nén chặt phôi. Hai điều kiện đáng xem xét trong quá trình phát triển phôi: các yếu tố tăng trưởng và sự di chuyển trong ống dẫn trứng. Phôi tiền làm tổ được dinh dưỡng từ các thụ thể TGF-α, HB-EGF, EGF, CSF, GM-CSF, PAF, PDGF, IGF-1, IGF-2, LIF, các yếu tố hoạt hóa, và các kết nối cho tất cả các thụ thể này hiện diện bên trong dịch tiết của tai vòi. Ngay cả trong sự vắng mặt của các yếu tố này, phôi vẫn sẽ được tiếp xúc với các yếu tố dinh dưỡng từ chính phôi tiết ra: TGF-α, TGF-β, IGF-1, IGF-2, VEGF, PDGF, PAF, LIF, GH, HLA-G và PGE2. Sự hiện diện của các yếu tố dinh dưỡng autocrine đã được đề xuất để giải thích các quan sát phôi của động vật có vú thường phát triển tốt hơn trong thể tích nhỏ hơn. Do đó, không nên quên rằng phôi thai làm thay đổi đáng kể đối với môi trường nuôi cấy chính nó. Còn trong cơ thể, phôi tiền làm tổ được vận chuyển vào trong thông qua ống dẫn trứng với sự co thắt nhịp nhàng của các cơ trơn. Do vậy, sẽ không đáng ngạc nhiên khi phôi tiền làm tổ có sự chịu đựng cao và thích nghi tốt hơn với môi trường bên ngoài.

Những gì một phôi không cần?

Một xem xét cho hệ thống nuôi cấy hiện tại và tương lai này là làm sao tránh hoặc giảm thiểu tiếp xúc của phôi với các điều kiện độc hại và stress. Phôi dễ nhạy cảm hơn so với hầu hết các loại tế bào khác và yếu tố độc hại có thể đến từ các đĩa nuôi cấy polystyrene hoặc polypropylene. Ngoài ra, sự hiểu biết của chúng ta về các chất độc cho phôi còn rất nghèo nàn, chúng ta biết rất ít về những gì nồng độ của hóa chất độc hại và thậm chí ít hơn về cơ chế độc tính của chúng. Nhìn chung, cách tiếp cận hiện tại là nên đề phòng để giảm thiểu tiếp xúc với embryotoxin thông qua việc kiểm soát nghiêm ngặt môi trường, trong đó bao gồm cấu tạo đặc biệt phòng thí nghiệm, môi trường phù hợp qui định, cùng với thử nghiệm nghiêm ngặt kiểm soát chất lượng. Một bước phòng ngừa bổ sung bao gồm các tác nhân, giúp hấp thụ hoặc giải độc độc tố trong môi trường nuôi cấy như EDTA để bắt ion kim loại nặng, như glutathione để bảo vệ chống các tác nhân oxy hóa, và albumin huyết thanh để hấp thu không đặc hiệu các chất độc khác. Một thủ phạm được công nhận là sự hiện diện của nồng độ cao amonium trong môi trường nuôi cấy. Amonium là một sản phẩm chất thải từ các xúc tác hoặc sự tương tác các acid amin, và cũng có thể phát sinh từ khử amin tự phát của acid amin có mặt trong môi trường nuôi cấy. Cuối giai đoạn tiền làm tổ, phôi chuyển đổi phần lớn tiêu thụ glucose từ lactate, cũng có thể làm giảm độ pH của môi trường nuôi cấy. Xử lý và kiểm tra phôi, hai bộ phận thiết yếu của giao thức nuôi cấy phôi hiện nay, cũng gây cho phôi bị stress. Chuyển phôi giữa các đĩa nuôi cấy hiện nay đòi hỏi các phôi được rút ra vào pipette một với nòng thường là không lớn hơn đường kính phôi. Nghiên cứu cho thấy thao tác của phôi với ống hút với đường kính bên trong là 1,5 × đường kính của phôi có thể cho kết quả trong sự cảm ứng của một số nội bào dấu hiệu bị stress. Trong hầu hết các phòng thí nghiệm về phôi, phôi thường xuyên được đánh giá sự phát triển bằng kính hiển vi sử dụng phổ rộng ánh sáng trắng. Có bằng chứng cho thấy, nếu phôi tiếp xúc với ánh sáng có thể nhìn thấy trong quang phổ màu xanh và đỏ thì có thể bị ảnh hưởng bất lợi đến sự phát triển của phôi tiền làm tổ.

Phân tích giao tử và phôi

Nhiều thập kỷ trước đây, các phân tích của phôi thường giới hạn ở mức đánh giá hình thái học. Xác định một số đặc điểm hình thái như sự hiện diện của nhiều hạt nhân hoặc phân mảnh rộng đã được chứng minh là một chỉ số đáng tin cậy để đánh giá những phôi bất thường. Tuy nhiên, cũng có chứng minh rằng nhiều phôi xuất hiện bình thường có bất thường nhiễm sắc thể ngăn cản khả năng cho ra một đứa trẻ khỏe mạnh. Và một loạt các phương pháp tiếp cận khác để phân tích sức khỏe và chức năng của giao tử và phôi được phát triển. Ngày nay, phương pháp chẩn đoán giao tử phôi thường được chia thành hai loại: xâm lấn và không xâm lấn. Phương pháp xâm lấn bao gồm tất cả các kỹ thuật phá vỡ tính toàn vẹn của giao tử hoặc phôi thai bằng cách loại bỏ một phần hoặc chèn một đối tượng bên ngoài vào các tế bào. Cách tiếp cận xâm lấn phổ biến nhất là cắt bỏ một hay vài tế bào của phôi thai để thực hiện phân tích di truyền, thường được gọi là chẩn đoán di truyền tiền làm tổ (PGD).

Những vấn đề thực tế cần xem xét

Mặc dù nghiên cứu y sinh có thể đưa ra nhiều công nghệ tiến bộ, vấn đề thực tiễn như độ tin cậy, chi phí và dễ sử dụng sẽ đóng vai trò lớn trong việc xác định những tiến bộ trở thành một phần của thực hành lâm sàng. Hỗ trợ sinh sản là một lĩnh vực rất tốn kém trên toàn thế giới. Trong năm 2002, chi phí trung bình cho một chu kỳ thụ tinh ống nghiệm là 3.518USD tại 25 quốc gia khác nhau trên thế giới. Chi phí phòng thí nghiệm chiếm từ 12-20% tổng chi phí. Những chi phí cao làm cho hỗ trợ sinh sản không có sẵn cho một bộ phận lớn dân số vô sinh, trong đó bao gồm khoảng 9% dân số toàn cầu. Như vậy, một mục tiêu quan trọng đối với hệ thống nuôi cấy trong tương lai là giúp giảm chi phí hỗ trợ sinh sản. Mỗi chu kỳ chi phí cho hỗ trợ sinh sản có thể được hạ xuống bằng cách giảm chi phí phòng thí nghiệm và/hoặc cải thiện tỉ lệ sinh sống. Những gì đơn giản nhưng hiệu quả của hệ thống nuôi cấy hiện tại sẽ được thiết lập cho hệ thống tiêu chuẩn cao trong tương lai. Điều này cũng sẽ bắt buộc hệ thống nuôi cấy trong tương lai phải rất đơn giản để thiết lập, độ tin cậy cao và dễ dàng để vận hành.

Thế nào là tốt đối với hệ thống nuôi cấy phôi hiện nay đáp ứng được các yêu cầu?

Ngày nay, phôi được nuôi trong các giọt nhỏ môi trường được đặt trên các đĩa nuôi cấy được che phủ với dầu, sau đó được lưu trữ trong tủ cấy để duy trì một hằng số nhiệt độ và môi trường khí. Thực tế là phương pháp này đã minh chứng cho thấy nhiều lợi thế của nó trong một thời gian dài, ví dụ như: nuôi cấy được nhiều phôi trên một đĩa cấy nên việc đánh giá và cập nhật sẽ dễ dàng; thể tích tương đối lớn của môi trường nuôi cấy cung cấp nguồn chất dinh dưỡng ở nồng độ tương đối ổn định và hồ chứa lớn để pha loãng chất thải; lớp phủ dầu bảo vệ chống lại sự bay hơi và cũng là một bộ tản nhiệt và khí, tạm thời bảo vệ phôi từ những biến động quan trọng này; các thông số khi mở cửa tủ cấy hoặc khi lấy đĩa cấy ra bên ngoài thực hiện. Tuy nhiên, đĩa cấy giọt dầu có một số thiếu sót của nó. Trước hết, chuẩn bị các đĩa cấy từ các dụng cụ tiêu hao với tay nhân viên làm trong phòng thụ tinh trong ống nghiệm trước khi sử dụng, trao đổi của môi trường nuôi cấy cũng được thực hiện bằng tay. Do vậy, nếu điều kiện nuôi cấy không tối ưu, phôi dễ mất yếu tố autocrine, và tiềm ẩn cú sốc đối với phôi vì được chuyển giữa môi trường với các thành phần khác nhau. Các tiêu chuẩn của thể tích được sử dụng trong các hệ thống đĩa giọt dầu cũng có một số nhược điểm. Một giọt nuôi cấy với thể tích 10µl sẽ gấp 1.800 lần thể tích của một phôi đường kính 110µm, làm loãng đáng kể các yếu tố autocrine và tiết ra protein từ phôi. Hơn nữa, khối lượng lớn cung cấp một hồ bơi lớn các chất dinh dưỡng nên không thể đánh giá mức tiêu thụ hoặc sản xuất các cơ chất nhất định do những thay đổi rất nhỏ. Một nhược điểm của hệ thống nuôi cấy hiện tại là tất cả các thao tác, chẳng hạn như rửa, trao đổi môi trường và phân tích, được thực hiện bên ngoài tủ cấy, đòi hỏi phải mở tủ cấy và lấy đĩa cấy ra ngoài. Việc mở cửa tủ cấy, với cặp cảm biến nhiệt điện CO₂ bên trong, chỉ có 11 lần mỗi ngày cho thấy làm giảm sự phát triển của phôi chuột giai đoạn tiền làm tổ. Tủ cấy tích hợp gần đây với hệ thống hình ảnh đã được phát triển để cho phép chụp mà không vi phạm buồng tủ cấy, nhưng hệ thống như vậy rất tốn kém và không giúp đỡ trong những tình huống trong đó môi trường cần thay đổi và các thao tác được yêu cầu.

Hệ thống nuôi cấy phôi trong tương lai

Cho đến gần đây, một trở ngại lớn đối với việc phát triển các hệ thống nuôi phôi theo lý thuyết là thiếu các công cụ công nghệ có khả năng xử lý số lượng các tế bào nhỏ và thể tích cần thiết cho nuôi cấy phôi đơn. Gần đây xuất hiện một phương thức microfluidics, có thể xử lý thể tích với đơn vị nanoliter, kích thước nhỏ không còn là một vấn đề. Đây là hệ thống nuôi cấy khá mới mẻ và được xem là tương lai của hệ thống nuôi cấy phôi. Hệ thống này được mô tả như là một hệ thống môi trường được cung cấp dưới dạng một dòng chất dinh dưỡng có chứa các yếu tố đi vào và đi ra. Điều này giúp cho phôi luôn được tiếp xúc với môi trường mới đầy đủ chất dinh dưỡng và các tín hiệu cho sự phát triển của chúng. Một lợi điểm khác là có thể lấy mẫu dễ dàng để phân tích các chỉ số có trong môi trường mà phôi sử dụng: carbohydrat, acid amine hay các yếu tố khác có liên quan đến tiềm năng phôi làm tổ…

Thể tích cấy nhỏ hơn

Một trong những hạn chế cho các hệ thống nuôi cấy trong tương lai là làm thế nào được thể tích tối ưu cho mỗi phôi. Hiện nay, rất ít công việc được thực hiện để giải quyết vấn đề này, và câu trả lời sẽ phụ thuộc vào một số yếu tố kết hợp với hệ thống nuôi cấy cụ thể như: (1) liệu môi trường nuôi cấy trong tương lai có thể thay thế các nhu cầu cho các yếu tố autocrine, (2) tỉ lệ tiêu thụ các chất dinh dưỡng và sản xuất các sản phẩm chất thải, (3) tối ưu tỉ lệ tích hợp của môi trường nuôi cấy và (4) những loại phân tích được thực hiện trên môi trường. Điều đó dự đoán rằng với bất kỳ hệ thống nuôi cấy, sẽ có một loạt các thể tích là tối ưu nhất; thể tích trên một điểm nhất định sẽ pha loãng yếu tố autocrine (nếu không được cung cấp ngoại sinh) và thể tích thấp hơn một mức nhất định sẽ làm cạn kiệt chất dinh dưỡng hoặc tích tụ sản phẩm dư thừa. Thể tích nhỏ hơn cũng sẽ cải thiện nhiều phân tích môi trường nuôi cấy bởi tăng độ lớn của những thay đổi ảnh hưởng bởi phôi. Xem xét các yếu tố này, có khả năng, ít nhất là trong tương lai gần, thể tích sử dụng trong hệ thống nuôi sẽ nhỏ hơn so với những gì đang được sử dụng, mặc dù môi trường làm mới này có thể cần được xây dựng cho việc thiết kế thiết bị để thích ứng những thể tích thấp hơn. Một hạn chế của việc giảm thể tích môi trường nuôi cấy là tỉ lệ thể tích tiếp xúc diện tích bề mặt sẽ tăng lên, điều này làm tăng nguy cơ tổn thất bay hơi và tiếp xúc các độc tố.

Nuôi cấy phôi động

Nhiều công việc hơn trong những năm tới sẽ giải quyết nhiều câu hỏi quan trọng về nuôi cấy phôi động như: dòng chảy liên tục hoặc không liên tục, tỉ lệ dòng chảy nào là tối ưu, làm thế nào các môi trường được trao đổi, và liệu dòng chảy gây ra chuyển động cho phôi thì có lợi? Một nghiên cứu gần đây bằng cách sử dụng một thiết bị như một cái phễu với kênh đầu vào và đầu ra nhỏ để cung cấp các dòng chảy nuôi cấy phôi chuột, kết quả sự phát triển phôi tiền làm tổ và mang thai đã được so sánh với những phôi đã phát triển trong cơ thể, và tốt hơn so với tỉ lệ phôi nuôi cấy trong các giếng mà không có dòng chảy hoặc trong giọt nhỏ có phủ dầu.

Khả năng thích nghi

Một tính năng quan trọng của bất kỳ hệ thống nuôi cấy phôi là nó là đủ linh hoạt để thích ứng với các giao thức khác nhau được sử dụng trong các phòng thí nghiệm khác nhau, cũng như các giao thức khác nhau được áp dụng đối với trường hợp lâm sàng cụ thể. Các thiết bị cho phương thức microfluidics rất thích hợp cho các nhu cầu như vậy. Các tùy chọn cho việc thiết kế thực tế không giới hạn và có thể nói rằng các thiết bị đã tồn tại sẽ dễ dàng được phát triển để thực hiện bất kỳ nhiệm vụ nào được thực hiện trong phòng thí nghiệm thụ tinh ống nghiệm. Khả năng nuôi cấy số lượng lớn phôi trong các phòng biệt lập cũng sẽ là một lợi ích cho các nghiên cứu phôi thai và chắc chắn sẽ được sử dụng cho các dự án chẳng hạn như tối ưu hóa môi trường nuôi cấy và sàng lọc các độc tính cho phôi.

Tình trạng hiện hành của lĩnh vực Microfluidics

Đây là giai đoạn rất sớm của việc áp dụng tiến bộ microfluidics và công nghệ nano vào hỗ trợ sinh sản. Các hệ thống nuôi cấy này cung cấp tất cả bằng chứng về nguyên tắc mà phôi có thể nuôi trong các thiết bị vi mô, và hầu hết đã chứng minh phát triển tương đương hoặc cải tiến hơn điều kiện nuôi cấy tiêu chuẩn. Các thiết bị này cũng chứng minh rằng chúng có thể được sử dụng để nuôi cấy phôi trong điều kiện mới như dòng chảy và thể tích cực nhỏ, và kết quả sơ bộ cho thấy rằng những điều kiện nuôi cấy mới có thể sẽ có lợi trong tương lai. Hiện nay có hơn 10 phòng thí nghiệm đang làm việc trên hệ thống nuôi cấy microfluidics và là nền tảng phân tích cho giao tử hoặc phôi. Trong giai đoạn phấn khích và cơ hội to lớn này, điều quan trọng là có rất nhiều nền tảng cần được thực hiện trước khi các thiết bị này đã sẵn sàng cho ứng dụng lâm sàng.

Hệ thống trong mơ

Với sự tiến bộ trong sự hiểu biết của chúng ta về phôi sinh học và công nghệ về nuôi cấy và phân tích phôi, một hệ thống nuôi cấy trong mơ thực chất khá đơn giản. Một hệ thống với đầu vào là giao tử và đầu ra là phôi nang với đánh giá định lượng tiềm năng phát triển. Một túi phôi được chấp nhận với tiềm năng phát triển cao, nếu có, sau đó có thể được load vào một cathether chuyển phôi và bất kỳ phôi tiềm năng phù hợp khác có thể được chuẩn bị để đông lạnh. Những thách thức khi thực hiện hệ thống trong mơ ước này có hai mặt: (1) tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để loại bỏ những tác hại không đáng có trong thời gian nuôi cấy và (2) phát triển các phương pháp có độ chính xác cao đánh giá tiềm năng phát triển của mỗi phôi nuôi cấy. Điều này đặt ra những thách thức rất lớn cho các nhà nghiên cứu phôi học.

Kết Luận

Trong thời gian ngắn của sự phát triển hệ thống nuôi cấy phôi, thật tuyệt vời để xem xét các thành tựu khoa học to lớn và tác động lâm sàng của chúng. Thật khó để tin rằng một thế hệ trước đây, nhiều bệnh nhân có ít hoặc không có cơ hội có con của riêng mình. Và hướng đến tương lai, các trung tâm đang dần cân bằng nhau một cách đáng kinh ngạc, đặc biệt phát triển về phôi học, di truyền học, công nghệ nano, và microfluidics. Có thể xem như là một quá trình mà phần lớn sử dụng, và do đó được xây dựng trên qui mô con người, cuối cùng trở thành một qui mô phù hợp cho phôi hơn. Trong thời gian tới, chúng ta sẽ dễ dàng nhận biết những dấu hiệu đầu tiên biểu hiện của một bộ gen mới, cũng như hiểu rõ những dấu hiệu phôi cho rằng họ có vấn đề nghiêm trọng với bộ gen của chúng, hoặc epigenome. Những tiến bộ này sẽ ảnh hưởng tốt đến bệnh nhân, nâng cao tỉ lệ trẻ em khỏe mạnh sinh ra thông qua ART và giảm các rào cản trong việc tiếp cận ART thông qua việc sử dụng hệ thống nuôi cấy năng động, chi phí thấp, thiết bị phân tích hiệu quả nhất.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

2. Brinster RL. A method for in vitro cultivation of mouse ova from two-cell to blastocyst. Exp Cell Res 1963;32:205-8.

4. Blake DA, Farquhar CM, Johnson N, Proctor M. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted conception. Cochrane Database Syst Rev 2007: CD002118.

5. Gardner DK, Lane M. Embryo culture systems. In: Gardner DK, ed. In Vitro Fertilization: A Practical Approach. New York: Informa Healthcare; 2007:221-82.

7. Pool TB. Recent advances in the production of viable human embryos in vitro. Reprod Biomed Online 2002;4:294-302.

8. Gardner DK. Dissection of culture media for embryos: the most important and less important components and characteristics. Reprod Fertil Dev 2008;20:9-18.

9. Summers MC, Biggers JD. Chemically defined media and the culture of mammalian preimplantation embryos: historical perspective and current issues. Hum Reprod Update 2003;9:557-82.

11. Gardner DK, Leese HJ. Concentrations of nutrients in mouse oviduct fluid and their effects on embryo development and metabolism in vitro. J Reprod Fertil 1990;88:361-8.

13. Gardner DK, Lane M, Calderon I, Leeton J. Environment of the preimplantation human embryo in vivo: metabolite analysis of oviduct and uterine fluids and metabolism of cumulus cells. Fertil Steril 1996;65:349-53.

14. Bavister BD. Stage-specific culture media and reactions of embryos to them. In: Jansen R, Mortimer D, eds. Towards reproductive certainty: fertility & genetics beyond 1999. Pearl River, New York: Parthenon; 1999:367-77.

16. Gardner DK, Lane M, Stevens J, Schoolcraft WB. Noninvasive assessment of human embryo nutrient consumption as a measure of developmental potential. Fertil Steril 2001;76:1175-80.

19. Richter KS. The importance of growth factors for preimplantation embryo development and in-vitro culture. Curr Opin Obstet Gynecol 2008;20:292-304.

21. Lane M, Gardner DK. Effect of incubation volume and embryo density on the development and viability of mouse embryos in vitro. Hum Reprod 1992;7:558-62.

22. Canseco RS, Sparks AET, Pearson RE, Gwazdauskas FC. Embryo density and medium volume effects on early murine embryo development. J Assist Reprod Genet 1992;9:454-7.

24. Lane M, Gardner DK. Ammonium induces aberrant blastocyst differentiation, metabolism, pH regulation, gene expression and subsequently alters fetal development in the mouse. Biol Reprod2003;69:1109-17.

25. Xie Y, Wang F, Puscheck EE, Rappolee DA. Pipettingcauses shear stress and elevation of phosphorylatedstress-activated protein kinase/jun kinase inpreimplantation embryos. Mol Reprod Dev2007;74:1287-94.

27. Van Soom A, Vandaele L, Goossens K, de Kruif A, Peelman L. Gamete origin in relation to earlyembryo development. Theriogenology 2007;68:S131-7.

30. Bouwmans CAM, Lintsen BME, Eijkemans MJC, et al.A detailed cost analysis of in vitro fertilization andintracytoplasmic sperm injection treatment. FertilSteril 2008;89:331-41.

32. Gardner DK, Lane M. Alleviation of the ‘2-cellblock’ and development to the blastocyst of CF1mouse embryos: role of amino acids, EDTA and physical parameters. Hum Reprod1996;11:2703-12.

35. Melin J, Quake SR. Microfluidic large-scaleintegration: the evolution of design rules for biologicalautomation. Annu Rev Biophys Biomol Struct2007;36:213-31.

37. Heo YS, Cabrera LM, Bormann CL, et al. Dynamicmicrofunnel culture enhances mouse embryodevelopment and pregnancy rates. Hum Reprod2010;25:613-22.

39. Vanneste E, Voet T, Le Caignec C, et al. Chromosomeinstability is common in human cleavage-stageembryos. Nat Med 2009;15:577-83.