ThS. Nguyễn Huỳnh Cẩm Tú – IVF Tâm Anh

Giới thiệu
Mặc dù các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (assisted reproductive technology - ART) đã tiến bộ đáng kể, nhưng tỷ lệ thành công vẫn còn thấp, chủ yếu do hạn chế trong việc chọn lựa phôi tối ưu. Hiện nay, việc chọn phôi dựa vào đánh giá hình thái học dưới kính hiển vi quang học, vốn thiếu độ chính xác và không phản ánh đầy đủ chất lượng sinh học của phôi. Một số kỹ thuật khác như sinh thiết phôi để phát hiện bất thường nhiễm sắc thể có tính xâm lấn và nguy cơ ảnh hưởng đến phôi. Do đó, cần thiết phát triển các phương pháp không xâm lấn dựa trên đặc điểm chức năng sinh học, đặc biệt là trạng thái chuyển hóa của phôi ở giai đoạn sớm. Hình ảnh chuyển hóa dựa trên huỳnh quang nội sinh của NAD(P)H và FAD, thu nhận thông qua các kỹ thuật quang học như FLIM hoặc hiển vi siêu phổ, được xem là công cụ tiềm năng cho mục tiêu này. Tuy nhiên, các kỹ thuật hiện tại còn hạn chế về độc quang và xử lý ảnh. Trong bối cảnh đó, hiển vi huỳnh quang chiếu sáng tấm mỏng (light-sheet fluorescence microscopy - LSFM) nổi lên như một giải pháp tối ưu nhờ khả năng thu nhận hình ảnh ba chiều nhanh, độc quang thấp. Tuy nhiên, LSFM truyền thống gặp khó khăn trong việc cố định và xử lý phôi nhỏ như phôi chuột. Nghiên cứu này đề xuất ứng dụng hệ thống vi lưu-quang học tích hợp LSFM (LSFM and microfluidics - LSFMMF) ngay trên vi mạch, cho phép ghi hình chuyển hóa NAD(P)H không xâm lấn ở phôi chuột giai đoạn sớm, đồng thời đánh giá tính an toàn và tiềm năng ứng dụng phương pháp này trong chọn phôi hiệu quả hơn.
Phương pháp
Nghiên cứu sử dụng mô hình phôi chuột hai tế bào (n = 115) nhằm đánh giá tính an toàn và hiệu quả của hệ thống LSFMMF trong ghi nhận hình ảnh chuyển hóa NAD(P)H. Sau khi được ghi hình, phôi tiếp tục được nuôi cấy trong 67 giờ để theo dõi sự phát triển, so sánh với nhóm đối chứng không xử lý và nhóm giả chỉ đưa qua thiết bị nhưng không chiếu sáng. Đánh giá chất lượng phôi nang được thực hiện bằng nhuộm huỳnh quang miễn dịch để định lượng tế bào lá nuôi (trophectoderm - TE) và khối tế bào bên trong (inner cell mass - ICM) trên 75 phôi. Ngoài ra, 18 phôi được xử lý bằng chất ức chế chuyển hóa FK866 nhằm xác minh vai trò sinh học của NAD(P)H. Thiết bị vi lưu được chế tạo bằng công nghệ quang khắc UV với thấu kính vi mô tích hợp tạo lớp chiếu sáng tấm mỏng trong kênh vi lưu, sử dụng ánh sáng đơn photon bước sóng 405 nm. Dữ liệu hình ảnh huỳnh quang thu được từ các phôi được dùng để huấn luyện mô hình mạng nơ-ron tích chập ResNet-34, nhằm dự đoán khả năng phát triển thành phôi nang, với độ chính xác được kiểm định bằng phương pháp kiểm định chéo 5 lần.
Kết quả
Phân bố không gian của NAD(P)H như một dấu ấn sinh học chuyển hóa trong phôi chuột sống
Thiết bị LSFMMF được thiết kế để xử lý mẫu một cách linh hoạt, cho phép nạp và thu hồi phôi dễ dàng mà không gây tổn thương, đồng thời duy trì điều kiện sinh lý ở 37°C trong suốt quá trình ghi hình. Phôi được vận chuyển bằng dòng chảy tầng với tốc độ kiểm soát (30 µm/giây) qua vùng chiếu sáng tấm mỏng, trong khi camera ghi lại chuỗi ảnh cắt lớp tạo thành ảnh 3D, phản ánh phân bố không gian của NAD(P)H trong từng phôi bào. Quá trình ghi hình diễn ra trong thời gian rất ngắn (<2 giây) nhằm giảm thiểu độc quang học. Cấu hình quang học của hệ thống, bao gồm lớp sáng mỏng (1,8 µm) và độ sâu tiêu cự cao, giúp đạt được hình ảnh huỳnh quang có độ tương phản cao. Tốc độ ghi hình và di chuyển phôi được tối ưu để tránh mất dữ liệu trong khi vẫn đảm bảo chất lượng hình ảnh và tính toàn vẹn sinh học của mẫu.
Điều biến hồ sơ chuyển hóa trong quá trình nuôi cấy phôi
Tổng cộng 34 phôi chuột được nuôi cấy từ giai đoạn hai tế bào đến phôi nang trong điều kiện in vitro, trong đó một nhóm được xử lý bằng FK866 làm giảm tổng hợp NAD(P)H nội sinh. Kết quả cho thấy, tỷ lệ phôi phát triển thành phôi nang ở nhóm xử lý chỉ đạt 22,2%, so với 80% ở nhóm đối chứng. Đồng thời, cường độ tín hiệu huỳnh quang NAD(P)H ở nhóm xử lý giảm 47% với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,0001).
Tối thiểu tổn thương quang học và tín hiệu ghi nhận cao bằng kính hiển vi đơn photon
Để xác định liều chiếu sáng tối đa mà phôi tiếp nhận, nhóm nghiên cứu đã mô phỏng phân bố năng lượng trong vùng chiếu sáng và tính toán mật độ năng lượng tại các tốc độ và công suất laser khác nhau, đảm bảo luôn dưới ngưỡng an toàn 50 J/cm². Trong nghiên cứu, liều sử dụng được chọn là 16 J/cm² nhằm giảm thiểu nguy cơ gây độc quang. Bên cạnh đó, hệ thống được thiết kế để quá trình ghi hình mỗi phôi chỉ diễn ra trong vòng <2 giây. Mặc dù liều ánh sáng thấp có thể làm giảm cường độ tín hiệu, kết quả cho thấy hình ảnh thu được từ thiết bị LSFMMF có tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (signal-to-noise ratio - SNR) vượt trội so với hiển vi huỳnh quang tiêu điểm (CFM), cao hơn 24,5 lần ở liều 8 J/cm² và 34 lần ở liều 16 J/cm², với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,00001). Điều này chứng minh rằng hệ thống không chỉ an toàn cho phôi mà còn mang lại chất lượng hình ảnh huỳnh quang vượt trội trong điều kiện chiếu sáng tối ưu.
So sánh CFM và LSFMMF
Việc sử dụng liều ánh sáng thấp thường đồng nghĩa với việc giảm cường độ tín hiệu huỳnh quang, ảnh hưởng đến chất lượng ảnh. Vì vậy, nhóm nghiên cứu đã đánh giá chất lượng hình ảnh bằng cách so sánh SNR giữa ảnh thu được từ LSFMMF với CFM ở cùng bước sóng kích thích 405 nm và các điều kiện nhằm hạn chế độc quang trong nghiên cứu phát triển phôi.
Kết quả hình ảnh từ ba phương pháp gồm: CFM, LSFMMF liều cao (16 J/cm²), và LSFMMF liều thấp (8 J/cm²) cho thấy sự khác biệt rõ rệt về độ sắc nét và cường độ tín hiệu. Hình ảnh chiếu cường độ cực đại (maximum intensity projection – MIP) từ LSFMMF cho thấy độ tương phản vượt trội so với CFM. Để so sánh định lượng, nhóm tác giả đã phân tích các đường cắt cường độ tại 5 vị trí khác nhau trong mỗi ảnh, sau đó so sánh với đường cắt nền tương ứng để tính SNR. Kết quả cho thấy SNR trung bình của ảnh thu được từ LSFMMF liều thấp cao hơn 24,5 lần so với CFM, và ở liều cao thì cao hơn 34 lần (P<0,00001 cho cả hai).
Khả năng sống và chất lượng phôi sau LSFMMF
Các phôi được chiếu ở hai mức năng lượng (8 J/cm² và 16 J/cm²) sau đó được thu hồi và nuôi cấy đến giai đoạn phôi nang. Quá trình phát triển của phôi được theo dõi mỗi 12 giờ để phân loại chính xác các giai đoạn phát triển. Kết quả cho thấy tất cả các nhóm đều có tỷ lệ phôi nang cao và không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm (P>0,05). Ngoài ra, phân tích về số lượng tế bào toàn phần và ICM của các phôi nang cũng cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về mặt hình thái hay số lượng tế bào giữa các nhóm.
Dự đoán sự hình thành phôi nang bằng hình ảnh chuyển hóa
Dữ liệu ảnh 3D huỳnh quang của phôi chuột hai tế bào, thu được từ LSFMMF được sử dụng để huấn luyện mạng nơ-ron tích chập ResNet-34. Từ tổng số 5.426 ảnh chuyển hóa, 3.473 ảnh đạt chất lượng được đưa vào huấn luyện, trong khi 1.126 ảnh còn lại được sử dụng làm tập kiểm tra mù theo phương pháp kiểm định chéo 5 lần. Mô hình cho kết quả chính xác trung bình 92,31%, với độ dao động từ 83,39% đến 97,34% và AUC trung bình đạt 0,974 cho thấy hiệu quả cao trong phân biệt phôi có và không có khả năng phát triển thành phôi nang.
Thảo luận
Nghiên cứu này là minh chứng đầu tiên cho thấy kỹ thuật ghi hình huỳnh quang  NAD(P)H trong phôi chuột giai đoạn sớm có thể thực hiện được bằng hệ thống LSFM mà không gây ảnh hưởng bất lợi đến sự phát triển hay chất lượng phôi. Hệ thống sử dụng ánh sáng đơn photon bước sóng 405 nm, cho phép thu ảnh nhanh (<2 giây), với cấu trúc quang học đơn giản và chi phí thấp. Thiết kế đặc trưng của hệ thống LSFM với hai thấu kính đặt vuông góc giúp hạn chế độc quang, do chỉ chiếu sáng một mặt phẳng mỏng tại một thời điểm, thay vì toàn bộ mẫu như ở các kỹ thuật hiển vi khác. Nhờ đó, kỹ thuật này có thể ứng dụng nguồn sáng cường độ thấp mà vẫn đảm bảo chất lượng hình ảnh cao. Vai trò thiết yếu của NAD(P)H trong phát triển phôi được xác minh thông qua can thiệp bằng chất ức chế FK866, cho thấy mối liên hệ giữa hoạt động chuyển hóa và khả năng phát triển thành phôi nang. Mặc dù tín hiệu 405 nm có thể kích thích các fluorophore khác, dữ liệu hình ảnh và phân bố đặc trưng chứng minh rằng tín hiệu thu được chủ yếu phản ánh NAD(P)H. Việc ghi nhận phân bố không gian của NAD(P)H mở ra hướng tiếp cận mới để đánh giá chất lượng phôi bên cạnh các tiêu chí hình thái học. Trong tương lai, hệ thống có thể tích hợp thêm đánh giá tỷ lệ NAD(P)H/FAD nhằm cung cấp chỉ số chuyển hóa toàn diện hơn, giúp phát hiện bất thường như lệch bội. Dù kỹ thuật hiện tại chưa phân biệt được giữa NADH và NADPH như FLIM, sự khác biệt này chưa chứng minh được ý nghĩa sinh học rõ ràng trong phôi sớm. Tuy nhiên, để ứng dụng lâm sàng, cần tiếp tục thực hiện các nghiên cứu tiền lâm sàng đánh giá độ an toàn lâu dài, bao gồm ảnh hưởng đến biểu hiện gene, tính toàn vẹn di truyền và sức khỏe của trẻ. Cuối cùng, mở rộng ứng dụng ghi hình ở giai đoạn phôi nang sẽ giúp nâng cao độ chính xác trong tiên lượng tiềm năng làm tổ trong ART.
Kết luận
Nghiên cứu đã phát triển thành công hệ thống LSFMMF để ghi nhận hình ảnh chuyển hóa NAD(P)H không xâm lấn từ phôi chuột giai đoạn sớm. Thiết bị sử dụng ánh sáng đơn photon 405 nm cho phép thu hình ảnh 3D nhanh chóng (<2 giây), với tỷ lệ SNR cao, đồng thời đảm bảo mức độ chiếu sáng an toàn, không ảnh hưởng đến sự phát triển và chất lượng phôi. Thiết kế tối ưu của hệ thống giúp kiểm soát vị trí và tốc độ di chuyển của phôi, giảm thiểu thao tác cơ học và duy trì điều kiện sinh lý ổn định trong suốt quá trình ghi hình. Công nghệ này có cấu trúc đơn giản, dễ triển khai, không yêu cầu hệ thống hiển vi phức tạp hoặc xử lý ảnh phức tạp, cho thấy tiềm năng ứng dụng thực tiễn trong cả nghiên cứu và lâm sàng. Hướng phát triển tiếp theo bao gồm tích hợp hệ thống nuôi cấy mô phỏng sinh học ngay trên chip và tối ưu thao tác đối với phôi giai đoạn muộn hơn như phôi nang. Đồng thời, các nghiên cứu tiền lâm sàng toàn diện, đặc biệt về an toàn lâu dài và ảnh hưởng đến sức khỏe trẻ là cần thiết trước khi chuyển giao công nghệ vào ứng dụng lâm sàng. Nếu được xác nhận là an toàn, kỹ thuật này có thể trở thành công cụ hỗ trợ chọn phôi không xâm lấn, chính xác và hiệu quả trong thực hành ART.
Từ khóa: chiếu sáng tấm mỏng trên vi mạch, hình ảnh chuyển hóa, vi hệ thống, chất lượng phôi, trí tuệ nhân tạo
Tài liệu tham khảo: Vargas-Ordaz E, Newman H, Austin C, Catt S, Nosrati R, Cadarso VJ, Neild A, Horta F. Novel application of metabolic imaging of early embryos using a light-sheet on-a-chip device: a proof-of-concept study. Hum Reprod. 2025 Jan 1;40(1):41-55. doi: 10.1093/humrep/deae249. PMID: 39521726; PMCID: PMC11700888.