Kỹ thuật lọc rửa tinh trùng trong điều trị thụ tinh trong ống nghiệm

Tin chuyên ngành

on Thursday 10-12-2020 2:36pm

Viết bởi: ngoc

CVPH. Nguyễn Thị Minh Anh - IVFMD Tân Bình

1. Nguyên tắc lọc rửa

Thành phần của tinh dịch sau khi xuất tinh bao gồm tinh tương và tinh trùng. Tinh tương đóng vai trò quan trọng trong quá trình di chuyển của tinh trùng trong đường sinh dục, nhờ hiện tượng “vón cục” nên tinh tương sẽ bảo vệ tinh trùng khỏi môi trường pH có tính acid của âm đạo. Bên cạnh đó, tinh tương còn cung cấp năng lượng chủ yếu cho tinh trùng giai đoạn đầu bao gồm fructose, acid citric và ATP. Tuy nhiên, một số thành phần trong tinh tương cũng có thể gây bất lợi cho khả năng thụ tinh của tinh trùng như các gốc oxy hoá tự do - ROS có nguồn gốc từ chính tinh trùng, tinh trùng non, tinh trùng chết và bạch cầu. Khi nồng độ ROS vượt quá mức sinh lý, các gốc tự do có thể tấn công các đại phân tử như DNA, protein, các acid béo trên màng tế bào, màng ti thể,... Trong mỗi tinh trùng lại thiếu hệ thống loại trừ các gốc oxy hoá tự do, dẫn đến tinh trùng dễ bị tác động bởi stress oxy hoá. Stress oxy hoá có thể ảnh hưởng đến chức năng của tinh trùng như mất khả năng thụ tinh, gây phân mảnh DNA hoặc gây chết tế bào [1].

Chuẩn bị tinh trùng là một khâu quan trọng không thể thiếu trong quy trình thụ tinh trong ống nghiệm. Mục đích của việc chuẩn bị tinh trùng là tách tinh trùng ra khỏi tinh dịch và cô đặc trong một thể tích nhỏ để sẵn sàng cho việc điều trị. Bên cạnh đó, khả năng sống và di động của tinh trùng giảm dần theo thời gian kể từ khi xuất tinh. Thời gian tinh trùng tiếp xúc với tinh dịch sau khi xuất tinh hơn 30 phút có thể làm giảm khả năng thụ tinh của tinh trùng. Chính vì vậy, cần phải phân lập tinh trùng càng sớm càng tốt sau khi mẫu được xuất tinh để loại bỏ các tác nhân gây hại cho tinh trùng [2]. Một số yếu tố cần quan tâm khi chuẩn bị tinh trùng bao gồm:

Chất lượng mẫu tinh dịch: Mẫu tinh dịch nên được đánh giá trước khi lọc rửa để lựa chọn phương pháp phù hợp. Bên cạnh đó, một số tác giả cho rằng thời gian kiêng xuất tinh cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng sau lọc rửa. Thời gian kiêng càng ít sẽ giúp giảm tỷ lệ phân mảnh DNA tinh trùng và tăng tỷ lệ phôi lưỡng bội [3], [4].
Môi trường lọc rửa: Phụ thuộc vào phương pháp và mục đích sử dụng để lựa chọn loại môi trường phù hợp.
Tốc độ ly tâm: Tốc độ và thời gian ly tâm cũng cần được điều chỉnh sao cho hiệu suất thu hồi tinh trùng cao và không ảnh hưởng đến sức sống của tinh trùng. Một số tác giả cho rằng ly tâm với tốc độ cao có thể gây tổn thương màng tinh trùng, tăng nồng độ ROS và phân mảnh DNA [5], [6].
Phương pháp chuẩn bị tinh trùng: Rửa đơn thuần, dựa trên sự di chuyển, thang nồng độ và một số phương pháp khác.

2. Các phương pháp lọc rửa tinh trùngPhương pháp rửa đơn thuần

Rửa đơn thuần là phương pháp chuẩn bị tinh trùng đơn giản và cổ điển nhất. Tinh dịch được pha loãng bằng môi trường nuôi cấy theo tỷ lệ 1:1, sau đó tiến hành ly tâm (2 - 3 lần) để loại bỏ tinh tương (tốc độ ly tâm 300 - 500g) [7]. Sau khi ly tâm, phần cặn thu được sẽ được đánh giá mật độ và di động, sau đó được dùng cho điều trị. Phương pháp này dễ thực hiện nhưng chỉ loại bỏ được tinh tương trong khi tinh trùng chết, tinh trùng bất thường, các tế bào trong tinh dịch như các tế bào mầm ống sinh tinh, bạch cầu, tế bào biểu mô,... vẫn hiện diện trong quần thể tinh trùng sau khi rửa. Sự hiện diện của các tế bào không phải tinh trùng này có thể gây ức chế khả năng thụ tinh của tinh trùng và tăng sự sản sinh ROS khi ly tâm [9].

a. Phương pháp dựa trên sự di chuyển

Trong in vivo, những tinh trùng tiềm năng có khả năng tự di chuyển ra khỏi tinh dịch để đi qua dịch nhầy cổ tử cung. Tương tự, tinh trùng di động tốt có khả năng di chuyển ra khỏi tinh dịch vào môi trường cấy. Dựa vào đặc điểm này, hai phương pháp bơi lên (swim- up) và bơi xuống (swim-down) được xây dựng. Phương pháp này giúp thu được tinh trùng có độ di động cao, loại bỏ được tinh trùng chết và tinh trùng bất động. Tuy nhiên, nó cũng có một số nhược điểm như không loại bỏ được tinh trùng di động có bất thường về hình dạng, không thu được hết dịch nổi chứa tinh trùng di động, không áp dụng được với những mẫu có độ nhớt cao và chỉ phù hợp với những mẫu có mật độ cao và di động tốt.

b. Phương pháp thang nồng độ

Có hai phương pháp được áp dụng để phân tách tinh trùng dựa trên tỷ trọng hoặc tỷ trọng riêng: thang nồng độ liên tục và không liên tục. Đối với phương pháp thang nồng độ liên tục, tỷ trọng các vật liệu thay đổi liên tục từ thấp đến cao, từ phần trên xuống đáy, trong khi ở phương pháp thang nồng độ không liên tục sử dụng các lớp có tỷ trọng giảm dần và lớp tỷ trọng thấp ở trên lớp tỷ trọng cao. Trong đó, phương pháp thang nồng độ không liên tục được sử dụng phổ biến hơn. Nguyên lý của phương pháp thang nồng độ không liên tục là các tế bào có tỷ trọng khác nhau sẽ bị giữ lại ở những lớp môi trường lọc có nồng độ khác nhau dưới tác động của lực ly tâm. Phương pháp này thường sử dụng với 2 lớp môi trường lọc: lớp 40% hoặc 45% ở trên và lớp 80 hoặc 90% ở dưới. Thành phần chính của môi trường là các hạt silica bọc silane, chính các hạt này sẽ giúp tinh trùng phân tách theo tỷ trọng của chúng. Tinh trùng có hình dạng bình thường và bất thường sẽ có tỷ trọng khác nhau. Tinh trùng trưởng thành có hình dạng bình thường sẽ có tỷ trọng khoảng 1,10 g/ml trong khi đó, tinh trùng chưa trưởng thành và tinh trùng hình dạng bất thường có tỷ trọng là 1,06 – 1,09 g/ml. Do đó, sau ly tâm tại mặt phân cách giữa lớp 40 và tinh dịch là các tế bào bạch cầu, mảnh vụn tế bào, trong lớp môi trường 40 là những tinh trùng bất động, tinh trùng chết, tại mặt phân cách giữa lớp 40 và 90 là các tế bào hồng cầu. Chỉ những tinh trùng di động có hình thái bình thường sẽ đi xuống lớp 90 và nằm ở đáy ống ly tâm [2]. Ưu điểm của phương pháp thang nồng độ là áp dụng được trên tất cả các mẫu, bao gồm mẫu có độ nhớt cao, mẫu có số lượng tinh trùng ít và khả năng di động kém với tỷ lệ thu hồi cao. Quần thể tinh trùng thu nhận được có di động tốt, phân lập được tinh trùng có chất lượng DNA tốt, loại bỏ được bạch cầu [8]. Nhược điểm của phương pháp này là sử dụng môi trường thang nồng độ có giá thành cao và có khả năng sinh ra nội độc tố nếu không được loại bỏ sạch sau quá trình ly tâm [9].

Bên cạnh đó, một số nghiên cứu gần đây khi kết hợp hai phương pháp thang nồng độ và swim-up cho kết quả khả quan. Trong nghiên cứu của Aldo và cộng sự (2016) tác giả thực hiện đánh giá ảnh hưởng của các phương pháp swim-up trực tiếp, swim-up cặn tinh trùng, thang nồng độ và thang nồng độ kết hợp swim-up lên tỷ lệ phân mảnh DNA tinh trùng. Kết quả cho thấy tỷ lệ phân mảnh DNA sau khi áp dụng từng phương pháp lọc rửa thấp hơn so với trước khi lọc rửa, đồng thời tỷ lệ phân mảnh DNA của phương pháp thang nồng độ kết hợp swim-up và swim-up cặn tinh trùng là thấp nhất [10].

c. Một số phương pháp lọc rửa tinh trùng khác

Ngoài các phương pháp đã nêu, hiện nay có một số phương pháp lọc rửa tinh trùng mới như lựa chọn tinh trùng dựa trên điện tích – microflow cell, dựa vào từ tính – MACs, dựa vào dòng chảy - microfluidics và phương pháp Zeta dựa trên điện tích màng của tinh trùng. Tuy nhiên, hầu hết các phương pháp này chưa được áp dụng rộng rãi trên lâm sàng.

3. Kết luận

Chuẩn bị tinh trùng là một trong những bước quan trọng của quy trình thụ tinh trong ống nghiệm. Hiện nay, lọc rửa tinh trùng dựa theo sự di chuyển và thang nồng độ đang được áp dụng rộng rãi. Ngoài ra, nhiều phương pháp khác cũng đang được nghiên cứu nhằm mục đích tăng hiệu quả chọn lọc tinh trùng. Lựa chọn phương pháp lọc rửa nào tuỳ thuộc vào chất lượng mẫu, nhu cầu và mục đích của từng trung tâm.

Tài liệu tham khảo

Henkel R (2012). ROS and semen quality. In: Agarwal A, Aitken RJ, Alvarez J, editors. Studies on Men’s Health and Fertility. New York, Humana Press, pp. 301-323
Björndahl L, Mortimer D, Barratt CLR, Castilla JA, Menkveld R, Kvist U, et al (2010). Sperm Preparation. In: A Practical Guide to Basic Laboratory Andrology. 1st ed. New New York: Cambridge University Press, pp.167-87
Agarwal, A., Gupta, S., Du Plessis, S., Sharma, R., Esteves, S. C., Cirenza, C., ... & Philby, S. (2016). Abstinence time and its impact on basic and advanced semen parameters. Urology, 94, 102-110
Scarselli, F., Cursio, E., Muzzì, S., Casciani, V., Ruberti, A., Gatti, S., ... & Greco, E. (2019). How 1 h of abstinence improves sperm quality and increases embryo euploidy rate after PGT-A: A study on 106 sibling biopsied blastocysts. Journal of assisted reproduction and genetics, 36(8), 1591-1597.
Arcidiacono A, Walt H, Campana A, Balerna M. The use of Percoll gradients for the preparation of subpopulations of human spermatozoa. Int J Androl 1983;6:433-45
Simon L, Zini A, Dyachenko A, Ciampi A, Carrell DT. A systematic review and meta-analysis to determine the effect of sperm DNA damage on in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection outcome. Asian J Androl 2017;19:80-90
World Health Organization (2010). WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. 5th ed. Geneva: WHO Press, pp.161-168
Jonge CJD (2017). Sperm Preparation for IVF and ICSI. In Gardner DK, editor. Handbook of In Vitro Fertilization, Fourth Edition, Boca Raton, FL: CRC Press, pp.131-142
Itani A (2013). Semen analysis and preparation. In: Coward K, Wells D, editors. Textbook of Clinical Embryology, Cambridge University Press, pp.245-248
Volpes, A., Sammartano, F., Rizzari, S., Gullo, S., Marino, A., & Allegra, A. (2016). The pellet swim-up is the best technique for sperm preparation during in vitro fertilization procedures. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 33(6), 765-770.