ThS. Lê Thị Bích Phượng- Chuyên viên phôi học- IVFMD Phú Nhuận

Trữ lạnh tinh trùng được biết đến lần đầu tiên vào năm 1776 khi Lazaro Spallanzani bảo quản tinh trùng trong tuyết. Trải qua chiều dài lịch sử, phương pháp này ngày càng được  phát triển và tiến bộ với việc phát hiện ra chất bảo quản trữ lạnh glycerol bởi Polge vào năm 1949, đánh dấu một bước ngoặt mới trong lĩnh vực bảo tồn khả năng sinh sản của nam giới [1]. Kể từ đó, đã có những cải tiến đáng kể trong kỹ thuật trữ lạnh tinh trùng trên động vật có vú và cho đến năm 1953, đứa trẻ đầu tiên được sinh ra từ tinh trùng trữ lạnh đã được báo cáo. Ngân hàng tinh trùng từ đó cũng ra đời và phát triển, ngân hàng tinh trùng người xuất hiện lần đầu tiên vào năm 1970. Mặc dù đạt được nhiều thành tựu nhưng việc tìm ra các phương pháp cải thiện kết quả sau rã đông mà đặc biệt là tỉ lệ tinh trùng sống sau rã vẫn là câu hỏi chưa có câu trả lời.
Trữ lạnh tinh trùng là một phương pháp hiệu quả để bảo tồn khả năng sinh sản của nam giới đặc biệt trong các trường hợp hoá trị, xạ trị dẫn đến suy tinh hoàn hoặc rối loạn khả năng phóng tinh [2]. Trong những trường hợp này, tinh trùng được trữ lạnh có thể rã ra sau đó để sử dụng cho IUI, IVF hay ICSI. Ngoài ra, kỹ thuật trữ lạnh còn được áp dụng trên những bệnh nhân không có tinh trùng trong tinh dịch, phải thu nhận tinh trùng từ mào tinh hoặc tinh hoàn và cho những bệnh nhân muốn trữ tinh trùng dự phòng [3]. Bên cạnh đó, kỹ thuật này cũng hỗ trợ cho việc xây dựng ngân hàng tinh trùng- giải pháp cho những trường hợp phải xin tinh trùng từ nguồn hiến tặng.

Phương pháp trữ lạnh tinh trùng
- Trữ lạnh chậm là phương pháp tinh trùng được làm lạnh dần dần trong khoảng thời gian từ 2-4 giờ trong 2 hoặc 3 bước theo cách trữ thủ công hoặc bằng máy tự động, tinh trùng được làm lạnh với tốc độ chậm khoảng 1-3 độ/phút giúp giảm nhiệt độ từ nhiệt độ sinh lý xuống nhiệt độ thấp vào khoảng -80^oC và sau đó được lưu trữ trong nitơ lỏng ở -196^oC. Chất bảo vệ trữ lạnh (CPA) thường được sử dụng trong phương pháp này bao gồm DMSO, PrOH hoặc Glycerol. Tế bào được tiếp xúc với CPA qua nhiều bước nhỏ với nồng độ CPA tăng dần nhằm giảm sốc thẩm thấu cho tế bào. Ưu điểm của phương pháp là tính an toàn cao do có sự cân bằng về tốc độ làm lạnh với nồng độ CPA. Tuy nhiên, trữ lạnh theo phương pháp này có nhược điểm là hình thành các tinh thể đá bên trong tế bào có thể gây tổn thương cho tinh trùng, đòi hỏi phải kiểm soát tốc độ làm lạnh ở giá trị nhất định để giảm những tổn thương do sốc thẩm thấu [4].

- Thuỷ tinh hoá là phương pháp trữ lạnh mà tinh trùng được xây dựng với mục đích trữ lạnh không có sự hình thành tinh thể đá nội và ngoại bào bằng cách tăng tốc độ làm lạnh và tăng nồng độ CPA. CPA được sử dụng trong kỹ thuật này bao gồm cả CPA có tính thấm và không có tính thấm qua màng tế bào. Tinh trùng được trộn với chất bảo vệ trữ lạnh, hỗn hợp tinh trùng và chất bảo vệ được cho vào các dụng cụ trữ chuyên dụng và được nhúng trực tiếp trong nitơ lỏng. Ưu điểm của phương pháp này là ngăn sự hình thành của tinh thể đá trong tế bào tinh trùng, rút ngắn thời gian thao tác, giảm chi phí tuy nhiên vấn đề lo ngại trong phương pháp này là lây nhiễm chéo giữa các mẫu [5].

Một số nghiên cứu đã được thực hiện nhằm đánh giá tính hiệu quả của hai phương pháp trên trong trữ lạnh tinh trùng nhưng kết quả vẫn còn trái ngược. Vào năm 2012, Isachenko và cộng sự đã báo cáo trường hợp sinh 2 bé khoẻ mạnh bằng ICSI sử dụng tinh trùng đông lạnh [6]. Một số nghiên cứu khác cho thấy chất lượng tinh trùng giảm sau thuỷ tinh hoá so với đông lạnh chậm. Tính toàn vẹn DNA và tỉ lệ di động của tinh trùng được chứng minh là không có sự khác biệt giữa hai phương pháp trữ lạnh [7]. Nghiên cứu của Chang và cộng sự cũng cho thấy rằng không có sự khác biệt về các thông số tinh dịch như tỉ lệ di động, tỉ lệ sống, hình dạng tinh trùng cũng như chỉ số phân mảnh DNA tinh trùng giữa hai kỹ thuật đông lạnh [8].

Một số tác động của quá trình trữ lạnh lên các thông số tinh trùng
Khả năng di động, chức năng màng, tính toàn vẹn nhiễm sắc chất và tổng số tinh trùng sống sau rã thường giảm so với mẫu trước khi trữ lạnh. Nijs và cộng sự đã báo cáo rằng tỉ lệ tinh trùng di động giảm từ 50,6% xuống 30,3% sau trữ đông [9]. Tuy nhiên cơ chế làm giảm độ di động đến nay vẫn chưa được biết rõ. Có mối tương quan thuận giữa tỉ lệ tinh trùng bất động với sai hỏng trong ti thể ở tinh trùng sau rã. Nghiên cứu này đề xuất rằng những thay đổi quá nhanh về áp suất thẩm thấu và sự hình thành tinh thể đá trong quá trình trữ lạnh có thể làm thay đổi thành phần protein và carbohydrate của màng từ đó phá vỡ cấu trúc màng làm giảm khả năng sống của tinh trùng [10].

Sản xuất ROS và giảm hoạt động của enzyme chống oxy hoá trong tinh trùng tạo ra các con đường apoptosis làm giảm khả năng sống của tinh trùng. Tính toàn vẹn DNA trong suốt quá trình trữ lạnh cũng là mối quan tâm của nhiều tác giả vì quá trình trữ lạnh dễ làm thay đổi tính chất màng ty thể và tăng sản xuất ROS từ đó dẫn đến quá trình oxy hoá DNA, gây đứt gãy DNA mạch đơn và mạch đôi. Ngoài ra, một số báo cáo cũng cho thấy có sự sai hỏng trong enzyme sửa chữa DNA tinh trùng sau trữ rã và đây cũng được xem là nguyên nhân gây sai hỏng DNA tinh trùng [11]. Những nghiên cứu sau này đã công nhận rằng sự thay đổi DNA trong quá trình trữ lạnh có thể do stress oxy hoá và các yếu tố apoptosis gây nên làm phá vỡ cấu trúc nucleoprotein, liên kết disulphide và phức hợp DNA-protamine [12].

Một thông số khác cũng được chứng minh bởi quá trình trữ lạnh là hình dạng tinh trùng. Một số báo cáo cho rằng sự thay đổi áp suất thẩm thấu làm biến dạng cấu trúc màng và do đó thay đổi hình dạng tinh trùng [10]. Tinh trùng bất thường hình thái được chứng minh là có mức độ tổn thương DNA cao hơn so với tinh trùng có hình dạng bình thường trong quá trình trữ lạnh. Một số thay đổi ở phần đuôi của tinh trùng như đuôi cuộn, đuôi có vòng cũng được quan sát thấy sau quá trình trữ rã.

Kết luận
Trữ lạnh tinh trùng là một kỹ thuật quan trọng trong điều trị thụ tinh trong ống nghiệm tuy nhiên kỹ thuật này được chứng minh là yếu tố gây tổn thương đến các thành phần tế bào và có thể ảnh hưởng bất lợi đến chức năng của tinh trùng. Hiện nay, việc lựa chọn phương pháp phù hợp để trữ tinh trùng hiệu quả vẫn còn gây tranh cãi. Tuỳ vào điều kiện của từng trung tâm, phương pháp trữ lạnh tinh trùng hiệu quả phải đáp ứng được các yếu tố như hạn chế tối đa tổn thương cho tế bào, tế bào sau rã có khả năng phục hồi hoạt động sinh lý, bên cạnh đó, tính thuận tiện, đơn giản cũng như dễ dàng trong việc đào tạo cũng là yêu cầu hàng đầu để lựa chọn phương pháp trữ. Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu báo cáo về tính hiệu quả của trữ lạnh tinh trùng trong hỗ trợ sinh sản trong nhiều thập kỷ qua, vẫn có nhiều khuyến cáo về việc theo dõi dài hạn trẻ sinh ra từ tinh trùng trữ lạnh nhằm đánh giá đầy đủ tính an toàn sinh học của kỹ thuật này.

Tài liệu tham khảo
[1]      M. Hezavehei, M. Sharafi, H.M. Kouchesfahani, R. Henkel, A. Agarwal, V. Esmaeili, A. Shahverdi, Sperm cryopreservation: A review on current molecular cryobiology and advanced approaches, Reprod. Biomed. Online. 37 (2018) 327–339.
[2]      C. Rousset-Jablonski, F. Chevillon, N. Dhedin, C. Poirot, [Fertility preservation in adolescents and young adults with cancer]., Bull. Cancer. 103 (2016) 1019–1034.
[3]      M. Di Santo, N. Tarozzi, M. Nadalini, A. Borini, Human Sperm Cryopreservation: Update on Techniques, Effect on DNA Integrity, and  Implications for ART., Adv. Urol. 2012 (2012) 854837.
[4]      A. Agarwal, E. Tvrda, Chapter 5 Slow Freezing of Human Sperm., Methods Mol. Biol. 1568 (2017) 67–78.
[5]      Y. Tao, E. Sanger, A. Saewu, M.C. Leveille, Human sperm vitrification: The state of the art, Reprod. Biol. Endocrinol. 18 (2020) 1–10.
[6]      V. Isachenko, R. Maettner, A.M. Petrunkina, K. Sterzik, P. Mallmann, G. Rahimi, R. Sanchez, J. Risopatron, I. Damjanoski, E. Isachenko, Vitrification of human ICSI/IVF spermatozoa without cryoprotectants: new capillary  technology., J. Androl. 33 (2012) 462–468.
[7]      E. Isachenko, V. Isachenko, I.I. Katkov, G. Rahimi, T. Schöndorf, P. Mallmann, S. Dessole, F. Nawroth, DNA integrity and motility of human spermatozoa after standard slow freezing versus cryoprotectant‐free vitrification, Hum. Reprod. 19 (2004) 932–939.
[8]      Y. Li, L. Zhou, M. Lv, P. Ge, Y. Liu, D. Zhou, Vitrification and conventional freezing methods in sperm cryopreservation: A systematic review and meta-analysis, Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 233 (2019) 84–92.
[9]      M. Nijs, E. Creemers, A. Cox, M. Janssen, E. Vanheusden, Y. Castro-Sanchez, H. Thijs, W. Ombelet, Influence of freeze-thawing on hyaluronic acid binding of human spermatozoa., Reprod. Biomed. Online. 19 (2009) 202–206.
[10]   S. Ozkavukcu, E. Erdemli, A. Isik, D. Oztuna, S. Karahuseyinoglu, Effects of cryopreservation on sperm parameters and ultrastructural morphology of  human spermatozoa., J. Assist. Reprod. Genet. 25 (2008) 403–411.
[11]   O.A. Bogle, K. Kumar, C. Attardo-Parrinello, S.E.M. Lewis, J.M. Estanyol, J.L. Ballescà, R. Oliva, Identification of protein changes in human spermatozoa throughout the  cryopreservation process., Andrology. 5 (2017) 10–22.
[12]   M. Yeste, E. Estrada, I. Casas, S. Bonet, J.E. Rodríguez-Gil, Good and bad freezability boar ejaculates differ in the integrity of nucleoprotein  structure after freeze-thawing but not in ROS levels., Theriogenology. 79 (2013) 929–939.