CNSH. Nguyễn Duy Khang – IVF Vạn Hạnh

1. Giới thiệu

Lịch sử đông lạnh tinh trùng người đã trải dài hơn 200 năm. Đông lạnh tinh dịch đầu tiên được thực hiện bởi Lazaro Spallanzani vào năm 1776, bằng cách đông lạnh tinh dịch trong tuyết. Ông cũng được biết đã thực hiện thành công thụ tinh nhân tạo đầu tiên nhờ vào đặc tính hồi phục khả năng di động của tinh trùng sau rã. Năm 1886, Mantegazza đã báo cáo, tinh trùng người có thể sống sót sau khi đông lạnh ở -17ºC trong hơn 4 ngày. Năm 1949, Polge đã phát hiện ra glycerol như một chất bảo vệ đông lạnh (cryoprotectants – CPA) tinh trùng hiệu quả. Kể từ đó, glycerol đã được sử dụng thường xuyên và được xem là một nền tảng trong đông lạnh tinh trùng. Em bé đầu tiên ra đời từ tinh trùng trữ lạnh được báo cáo bởi Bunge và Sherman vào năm 1953. Năm 1963, Sherman đã cho thấy tinh trùng có thể trữ trong một thời gian dài ở nhiệt độ -196ºC trong ni tơ lỏng (liquid nitrogen - LN2).
 

2. Cơ chế của quá trình đông lạnh tinh trùng

Đông lạnh đề cập đến việc bảo tồn khả năng sống cho tế bào ở nhiệt độ dưới 0ºC trong một thời gian xác định. Nhiệt độ của LN2 cho phép đông lạnh tế bào trong thời gian dài do các phản ứng sinh hoá ngừng lại vì thiếu nhiệt năng. Thêm vào đó, sự vắng mặt của nước ở trạng thái lỏng hạn chế tất cả quá trình trao đổi chất. Do đó, việc trữ lạnh trong LN2 ở -196ºC đã trở thành tiêu chuẩn.
 
Màng tế bào của tinh trùng có tính lỏng cao do hàm lượng sterol cao. Hàm lượng cao acid béo không no nhiều nối đôi giúp ổn định màng trong quá trình đông lạnh, giúp tinh trùng sống sót khi nhiệt độ hạ nhanh và ít nhạy cảm với sốc lạnh. Do đó, thành phần chất béo trong màng tế bào là nhân tố chính ảnh hưởng đến khả năng chịu lạnh cũng như sự nhạy cảm với nhiệt độ lạnh.
 
Khả năng sống của tế bào phụ thuộc phần lớn vào tốc độ đông lạnh và rã đông. Tốc độ đông lạnh phải đủ chậm để tránh hình thành tinh thể đá nội bào và đủ nhanh để không làm cho tế bào mất nước quá nhiều. Tinh thể đá hình thành khi nước được làm lạnh dưới điểm đóng băng. Các tinh thể này nhẹ hơn và có thể tích lớn hơn nước ở dạng lỏng. Sự nở rộng tinh thể băng trong quá trình đông đặc là nhân tố chính gây ra áp lực lên các bào quan, dẫn đến tổn thương.
 
Khi nước đông đặc, các chất hoà tan hiện diện trong nước bị loại khỏi tinh thể băng, dẫn đến điểm đóng băng của thành phần không đông bị hạ thấp. Dung dịch trở nên ưu trương khi nhiệt độ hạ xuống, dẫn đến sốc thẩm thấu, làm giải phóng các gốc oxy hoá tự do (reactive oxygen species – ROS) gây hại cho tinh trùng.
 

3. Ứng dụng lâm sàng của tinh trùng trữ lạnh

Ngày nay, đông lạnh tinh trùng được sử dụng rộng rãi như một kỹ thuật thường quy. Nam giới có thể trữ lạnh tinh trùng của mình trước những trường hợp gây giảm khả năng sinh sản, chẳng hạn như bệnh nhân ung thư bắt đầu hoá trị hay xạ trị, trước khi trải qua phẫu thuật có thể ảnh hưởng đến chức năng tinh hoàn hoặc gây rối loạn chức năng sinh dục, trước khi khởi phát một số bệnh như bệnh tự miễn.
 
Hơn nữa, trữ lạnh tinh trùng cũng là một nền tảng trong công nghệ hỗ trợ sinh sản, chủ yếu giải quyết các vấn đề vô sinh. Bệnh nhân vô sinh do yếu tố nam như oligozoospermia hoặc tinh trùng di động không tiến tới được khuyên trữ lạnh tinh trùng. Trữ lạnh cũng được sử dụng phổ biến cho tinh trùng thủ thuật. Thụ tinh nhân tạo cũng là một biện pháp cho bệnh nhân vô tinh hoặc người mẹ đơn thân từ tinh trùng trữ của những người hiến khoẻ mạnh.
 

4. Phương pháp đông lạnh tinh trùng

Kỹ thuật đông lạnh được sử dụng trong trữ lạnh tinh trùng liên quan đến hai phương pháp là đông lạnh chậm và thuỷ tinh hoá.
 
Đông lạnh chậm là phương pháp làm lạnh tinh trùng dần dần trong 2 hoặc 3 bước, theo cách thủ công hoặc bằng máy tự động. Đông lạnh chậm có thể dẫn đến tổn thương tế bào do hình thành tinh thể đá nội bào, co nguyên sinh hoặc thay đổi áp suất thẩm thấu trong tế bào.
 
Nhằm khắc phục những nhược điểm này của đông lạnh chậm, thuỷ tinh hoá đã được đề xuất. Kỹ thuật thuỷ tinh hoá dựa trên việc đông lạnh tinh trùng bằng cách nhúng trực tiếp vào LN2 ở -196ºC. Việc này bỏ qua sự hình thành tinh thể đá nội bào. Thuỷ tinh hoá đòi hỏi tốc độ đông lạnh cực nhanh (>100.\000°C/phút), có thể ngăn ngừa sự co rút và tổn thương do sốc thẩm thấu. Phương pháp này có thể tránh được sự hình thành tinh thể đá, yêu cầu thiết bị tối thiểu, hiệu quả về thời gian và chi phí. Đây là một giải pháp thay thể đầy hứa hẹn cho phương pháp đông lạnh thông thường.
 

5. Chất bảo vệ đông lạnh

CPA là những chất có độ hoà tan cao, được sử dụng để bảo vệ mô sinh học khỏi sốc lạnh trong quá trình đông lạnh. CPA làm thay đổi nồng độ chất tan trong pha lỏng bằng cách di chuyển nước từ môi trường nội bào ra môi trường ngoại bào, hạ điểm đóng băng của dung dịch, hạn chế sự kết tinh của nước và tổn thương tế bào sau đông lạnh. Dựa vào khả năng xuyên màng tế bào, CPA gồm hai loại: thẩm thấu và không thẩm thấu.
 
CPA thẩm thấu là những hợp chất có trọng lượng phân tử tương đối thấp (<100g/mol), tự do xuyên màng theo thang áp suất thẩm thấu. Với khả năng hình thành liên kết hydro với nước, chất này ngăn cản sự kết tinh của tinh thể đá. Dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol, propylene glycol (PROH) và glycerol là một trong những CPA thẩm thấu được sử dụng phổ biển nhất.
 
CPA không thẩm thấu là các phân tử lớn, được giữ lại ở ngoại bào. Chất này tạo thang áp suất thẩm thấu bằng cách hút nước từ môi trường nội bào và chủ yếu được sử dụng kết hợp với CPA thẩm thấu để giảm độc tính cho tế bào. Sucrose, raffinose và trehalose là những CPA không thẩm thấu được sử dụng phổ biến. Hầu như tất cả CPA được sử dụng thường quy trong đông lạnh tinh trùng đều chứa glycerol như là một chất chống sốc nhiệt, đường cho năng lượng và tối ưu hoá độ pH và độ thẩm thấu, lòng đỏ trứng cho tính lỏng và tính toàn vẹn của màng tế bào, kháng sinh để tránh nhiễm khuẩn.

6. Những thay đổi trong đặc điểm tinh trùng trong quá trình đông lạnh

Những tổn thương đáng kể về cấu trúc và chức năng tinh trùng sau đông lạnh đã được báo cáo. Những thay đổi này liên quan đến giảm mạnh độ di động chủ yếu do thay đổi màng tế bào và thoái hoá acrosome.
 
Thay đổi dễ quan sát nhất là vùng acrosome. Có sự phân huỷ một phần hoặc toàn bộ màng và suy giảm hàm lượng acrosome. Hình dạng bất thường ở vùng thân và đuôi gia tăng đáng kể, trong đó đuôi cuộn lại là phổ biến nhất. 
 
Thay đổi nhanh về độ thẩm thấu và hình thành tinh thể đá nội bào có thể dẫn đến thay đổi thành phần protein và carbohydrate của màng tế bào. Giảm khả năng di động và trao đổi ion, dẫn đến giảm khả năng sống và thụ tinh của tinh trùng.
 
Quá trình đông lạnh phá huỷ cấu trúc màng ty thể và thay đổi tính lỏng của màng, dẫn đến giải phóng ROS. ROS là tác nhân gây tổn thương tế bào, làm đứt gãy DNA mạch đơn hay đôi, gây apoptosis. Việc đông lạnh tinh trùng có tác động tiêu cực đến tính toàn vẹn DNA và gây ra sự phân mảnh do ROS. C ũng có ý kiến khác cho rằng, tính toàn vẹn DNA không bị ảnh hưởng bởi quá trình đông lạnh. Sự khác biệt có thể do phương pháp đông lạnh hoặc phương pháp đánh giá tính toàn vẹn DNA (TUNEL, SCSA, SCD, Comet).
 

7. Các thay đổi khác sau đông lạnh tinh trùng (proteomic, transcriptomic/ epigenomic)

Quá trình đông lạnh không chỉ thay đổi các chỉ số tinh trùng mà còn ảnh hưởng lên bộ gene, sự ổn định của mRNA, sự biểu hiện protein và thượng di truyền của tinh trùng.
 
Đông lạnh tinh trùng có ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát triển của phôi giai đoạn sớm do tăng nguy cơ mất các bản sao và các tương tác protein. Một số bản sao có vai trò trong khả năng sinh sản của tinh trùng người, như PRM1, PRM2, PEG1/MEST, eif2S1 và ADD1 suy giảm biểu hiện sau đông lạnh.
 
Một số nghiên cứu về thượng di truyển cho thấy sự thay đổi trong các protein liên kết histone H1-DNA, liên kết disulfide protein-DNA và vùng khởi động vasa và cxcr4b. Có một nghiên cứu về mô hình methy hoá DNA của gene tinh trùng người, tuy nhiên, báo cáo chỉ ra không có thay đổi nào trước và sau khi đông lạnh.
 

8. Giải pháp cho tổn thương lạnh

Tổn thương lạnh có thể được hạn chế bằng cách sử dụng một số chất có đặc tính bảo vệ đông lạnh. CPA, tuỳ thuộc vào kích thước phân tử và độ thẩm thấu, có tác dụng bảo vệ đông lạnh, giảm điểm đóng băng của nước trong môi trường nội bào và ngoại bào. Những chất chống oxy hoá như vitamin E, vitamin C, catalase, l-carnitine, biotin, hyaluronic acid, resveratrol và mật ong hoạt động chủ yếu để trung hoà ROS được tạo ra trong quá trình đông lạnh, do đó cải thiện chức năng tinh trùng sau rã. Các protein và glycoprotein chống đông có thể được sử dụng nhằm duy trì tính toàn vẹn của màng sinh chất bằng cách ổn định phospholipid và acid béo không no. Các thành phần khác giúp giảm tổn thương bao gồm acid béo, huyết thanh động vật, hạt nano hoặc tinh dầu thực vật.
 
Các chiến lược khác nhằm giảm tổn thương lạnh cho tinh trùng như sử dụng nước nhiễm từ, cho tinh trùng thích nghi với stress trước khi đông lạnh nhằm tạo sự thích nghi và sử dụng laser công suất thấp để tác động đến chuỗi hô hấp tế bào giúp tăng sản xuất ATP trong khi giảm ROS.
 

9. Đông lạnh tinh trùng có và không có tinh dịch

Các tế bào sinh dưỡng chứa chất chống oxy hoá trong tế bào chất, giúp bảo vệ khỏi tổn thương do quá trình oxy hoá. Tuy nhiên, trong quá trình trưởng thành, tinh trùng mất phần lớn tế bào chất. Việc này dẫn đến thiếu hụt các enzyme và cơ chế sửa chữa thương tổn do quá trình oxy hoá, làm cho tinh trùng nhạy cảm với ROS. Tinh dịch có hoạt tính kháng ROS do tác dụng của các enzyme như superoxide dismutase, glutathione reductase, peroxidase và catalase. Bên cạnh đó, các lipoprotein đóng vai trò ổn định màng tế bào bằng cách duy trì thành phần lipid tối ưu. Các nghiên cứu về đặc tính kháng oxy hoá của tinh dịch người và chuột đã được mô tả và chứng minh. Do đó, trữ lạnh tinh trùng với tinh dịch được ủng hộ bởi những lý do trên.
 
Các nghiên cứu tách tinh trùng khỏi sự bảo vệ của tinh dịch và cho thấy tác động tiêu cực của ROS lên các bào quan như DNA. Tuy nhiên, những tổn thương này được chứng minh có thể ngăn ngừa bằng cách bổ sung vào môi trường chất chống oxy hoá. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho rằng bạch cầu và tinh trùng chết trong tinh dịch giải phóng ROS, ảnh hưởng đến tinh trùng trong mẫu xuất tinh khi tiếp xúc lâu dài, làm giảm độ di động và khả năng sống của tinh trùng. Do đó, ý kiến cho rằng, tinh trùng nên được tách khỏi môi trường tinh dịch càng sớm càng tốt.
 

10. Nhân tố ảnh hưởng đến kết cục chu kỳ đông lạnh tinh trùng

Khả năng kháng lại tổn thương lạnh phụ thuộc vào kích thước, hình dạng và thành phần lipid của tinh trùng. Sự khác biệt thành phần, cấu trúc acid béo và tỷ lệ omega-3/ omega-6 quyết định mức độ chịu lạnh của tinh trùng.
 
Các đặc tính trước khi đông lạnh của tinh trùng ảnh hưởng đến chất lượng mẫu sau rã. Ví dụ, tinh trùng di động bất thường như asthenozoospermia và oligoasthenozoospermia được báo cáo là dễ bị tổn thương do đông lạnh. Ngoài ra, thời gian kiêng xuất tinh được chứng minh là có ảnh hưởng đến tỷ lệ tinh trùng sống sau rã. Các mẫu bất thường dễ bị tổn thương DNA trong quá trình trữ - rã, tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể cao hơn và khả năng kháng lại sự biến tính do nhiệt giảm so với các mẫu tinh trùng bình thường.
 
Bên cạnh những yếu tố này, phương pháp đông lạnh (đông lạnh chậm hoặc thuỷ tinh hoá), sử dụng hoặc không sử dụng CPA (thẩm thấu hoặc không thẩm thấu hoặc kết hợp cả hai), nồng độ của CPA hoặc các thành phần được thêm vào có ảnh hưởng đáng kể đến kết cục trữ lạnh. Trong các quy trình khác nhau, tốc độ đông lạnh - rã đông, nhiệt độ mẫu được đưa vào LN2 và nhiệt độ bảo quản có ảnh hưởng đáng kể đến kết cục của chu kỳ trữ rã.
 

11. Tương lai của đông lạnh tinh trùng

Trữ lạnh tinh trùng đã được sử dụng để bảo tồn khả năng sinh sản của nam giới trưởng thành. Bên cạnh đó, cần tiếp tục nghiên cứu ứng dụng trong bảo tồn khả năng sinh sản cho nam giới trước tuổi dậy thì. Tế bào mầm trong tinh hoàn là lựa chọn thay thế đầy hứa hẹn cho tinh trùng trong mẫu xuất tinh. Ngoài ra, thuỷ tinh hoá được xem là một công nghệ đầy hứa hẹn cần nghiên cứu thêm. Cho đến nay, các quy trình thuỷ tinh hoá được thực hiện với thể tích mẫu tinh dịch rất nhỏ, khoảng 10 - 30 μl. Mặc dù việc sử dụng thuỷ tinh hoá được khuyến khích, một số nghiên cứu cho thấy những ảnh hưởng bất lợi đến chất lượng giao tử sau rã đông.
 

12. Kết luận

Hiểu biết thấu đáo về những thay đổi thượng di truyền và proteomic do đông lạnh tinh trùng sẽ cho phép ứng dụng lâm sàng hiệu quả. Cần một quy trình thuỷ tinh hoá tiêu chuẩn vì ưu điểm đầy hứa hẹn so với phương pháp thông thường.
 
Nguồn: Sharma, Y., & Sharma, M. (2020). Sperm cryopreservation: principles and biology. Journal of Infertility and Reproductive Biology, 8(3), 43-48

Từ khóa: đông lạnh, tinh trùng, bảo tồn khả năng sinh sản, chất bảo vệ đông lạnh, sinh học đông lạnh