CNSH. Đặng Thị Huyền Trang – IVFMD Tân Bình

     I.         Giới thiệu
Kỹ thuật sinh thiết phôi được phát triển như là một công cụ nhằm hỗ trợ chẩn đoán di truyền phôi trong lĩnh vực hỗ trợ sinh sản. Tuy nhiên, hiệu quả của kỹ thuật này vẫn còn chưa thực sự được công nhận. Việc chẩn đoán sai dẫn đến độ nhạy và độ đặc hiệu thấp cũng như nguy cơ gây tổn thương phôi khi sinh thiết là một trong những nhược điểm lớn của PGT-A. Kỹ thuật sinh thiết có thể chia thành 2 nhóm: nhóm thực hiện khoan mở ZP vào giai đoạn phôi ngày 3 sau đó nuôi đến ngày 5 và nhóm thực hiện khoan mở ZP ở giai đoạn phôi ngày 5. Hiện nay, chưa có quy trình kỹ thuật cụ thể thống nhất cho quá trình sinh thiết phôi. Bài viết này tổng quan trình bày những vấn đề đang còn gây tranh cãi về việc sử dụng kỹ thuật sinh thiết phôi trên lâm sàng.

   II.         Các vấn đề liên quan trong quy trình sinh thiết
1.    Phương pháp sinh thiết: nên khoan mở ZP hay không?
Các báo cáo lâm sàng đầu tiên về xét nghiệm di truyền tiền làm tổ (PGT) sử dụng kỹ thuật sinh thiết phôi giai đoạn phôi phân chia đã được công bố từ những năm 1990. Song song đó, các tác giả khác cũng bắt đầu nghiên cứu kỹ thuật sinh thiết tế bào TE của phôi nang và chứng minh tính khả thi của phương pháp này trong đánh giá di truyền phôi tiền làm tổ. Ban đầu, sinh thiết phôi giai đoạn phân chia phổ biến hơn, với kỹ thuật đánh giá di truyền phôi được chọn là FISH. Trường hợp trẻ sinh sống đầu tiên sau sinh thiết phôi nang làm PGT đã được báo cáo vào năm 2002.

Để có thể dễ dàng lấy được tế bào phôi, việc bắn laser vào màng ZP được thực hiện vào ngày thứ 3 hoặc ngày 4 nhằm lấy ra khoảng 2-9 tế bào. Cách này cũng thường được áp dụng trong các thử nghiệm lâm sàng. Một cách tiếp cận khác, đó là phương pháp sinh thiết phôi không mở ZP. Capalbo và cộng sự mô tả kỹ thuật trực tiếp sinh thiết phôi không hỗ trợ thoát màng lần đầu vào năm 2014 và chứng minh lợi ích của phương pháp này cũng như nhấn mạnh tầm quan trọng của thời điểm sinh thiết phôi nang đã thoát màng [1]. Ở phương pháp này, nếu các tế bào TE thoát ra quá mức hoặc xảy ra hiện tượng xẹp phôi nang khi sinh thiết chọc hút TE sẽ làm quy trình sinh thiết trở nên khó khăn hơn và có nguy cơ cao ảnh hưởng đến lớp tế bào ICM bên trong. Hơn nữa, khi phôi nang bị xẹp đi, sẽ làm kéo dài thời gian sinh thiết, dù khuyến cáo là chỉ nên thực hiện tối đa trong vòng 3 phút [2]. Hiện nay vẫn chưa có dữ liệu lâm sàng cho thấy phương pháp sinh thiết nào là ưu việt hơn.

2.    Thời điểm tối ưu để khoan mở ZP: giai đoạn 8 tế bào hay giai đoạn phôi nang?
Khi thiết lập quy trình tiêu chuẩn để sinh thiết phôi, cần cân nhắc thời điểm tối ưu để khoan mở ZP trong giai đoạn phôi phân chia hoặc giai đoạn phôi nang. Việc tác động vào ZP ở ngày 3 có nguy cơ ảnh hưởng đến việc thoát màng của các tế bào ICM, làm thất thoát các vật liệu di truyền. Theo Rubino và cộng sự (2014), phương pháp khoan ZP kép có thể là một kỹ thuật hỗ trợ hữu ích nhằm tránh được hiện tượng thoát ICM với tỷ lệ là 3,0% (6/199).
Các dữ liệu lâm sàng đã chỉ ra rằng việc thoát màng ở lớp tế bào ICM không làm tăng tỷ lệ song thai cùng trứng [3]. Và nếu một phần tế bào ICM bị hút ra cùng với các tế bào TE trong quá trình sinh thiết cũng không ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của phôi sau khi sinh thiết. Tuy nhiên, lớp ICM cũng là lớp tế bào quan trọng giúp hình thành nội bì ở giai đoạn phôi sớm. Do đó, cần chú ý chỉ nên lấy lớp TE và khoan laser kép nhằm giảm thiểu ảnh hưởng tới lớp ICM. Ngoài ra, khoan ZP trong giai đoạn phôi phân chia có thể gây thoát tế bào sớm trong giai đoạn đầu của phôi (lúc này số lượng tế bào khá ít). Mặc dù tổng số tế bào trong phôi nang chưa được nghiên cứu đầy đủ, Hardy và cs. (1989) đã chỉ ra rằng số lượng tế bào TE trung bình lần lượt là 37,9, 40,3 và 80,6 ở giai đoạn phôi ngày 5, ngày 6 và ngày 7. Nghiên cứu của Fong và cs. (1999) đã báo cáo rằng số lượng tế bào dao động từ 160,9 đến 236,7 trong phôi nang có chất lượng tốt và từ 43,7 đến 84,0 ở phôi chất lượng kém vào sáng ngày 6. Ngoài ra, một báo cáo gần đây cho thấy số lượng tế bào là 225,2 và 121,1 trong phôi nang nở và không nở [4]. Do đó, có thể có sự khác biệt lớn hơn về số lượng tế bào giữa các cấp độ của phôi nang và thời gian sau khi thụ tinh; những khác biệt này có thể là do hệ thống nuôi cấy (tủ ấm, môi trường nuôi cấy, …) dẫn đến sự thay đổi về tốc độ phát triển của phôi. Dù là trường hợp nào, chuyên viên sinh thiết phôi cũng nên cân bằng số lượng tế bào được sinh thiết trên tổng số tế bào khi sinh thiết TE nhằm duy trì kích thước phôi nang sau sinh thiết cũng như giảm thiểu các tác động bất lợi (nếu có) của quá trình sinh thiết lên phôi. Hơn nữa, việc tiếp tục nuôi cấy đến giai đoạn phôi nang đầy đủ có thể có thêm lợi ích trong việc đánh giá phân loại hình thái phôi, giúp lựa chọn những phôi đủ tiêu chuẩn để sinh thiết. Tóm lại, việc khoan mở ZP vào thời điểm ngày thứ 3 đến ngày thứ 4 sau khi thụ tinh có thể dẫn đến nguy cơ bị thất thoát vật liệu di truyền ở lớp tế bào ICM cao hơn so với  thời điểm đã tạo thành phôi nang ở ngày 5, ngày 6.

3.    Những yếu tố cần đánh giá trong quy trình sinh thiết phôi
·      Số lượng tế bào TE cần sinh thiết
Số lượng tế bào được sinh thiết là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sinh thiết phôi. Theo đồng thuận thế giới hiện tại, số lượng tế bào tối thiểu lấy ra sinh thiết là 5 tế bào. Tuy nhiên, rất khó để áp dụng điều này trong thực hành lâm sàng. Sinh thiết lấy quá ít tế bào có thể sẽ ít gây xâm lấn hơn nhưng dẫn đến nguy cơ thất bại trong khuếch đại tín hiệu di truyền. Trong khi đó, việc lấy nhiều tế bào có thể giúp lấy đủ vật liệu di truyền để khuếch đại tín hiệu nhưng sẽ làm tăng nguy cơ ảnh hưởng đến sự phát triển phôi sau này. Sinh thiết phôi nang cho tỷ lệ thất bại khuếch đại tín hiện di truyền thấp hơn do số lượng tế bào thu được từ sinh thiết cao hơn so với sinh thiết thể cực hoặc sinh thiết phôi bào ngày 3. Theo Cimadomo và cộng sự (2018) cần phải có khoảng 8 tế bào TE để khuếch đại DNA thành công và đưa ra kết quả chẩn đoán chính xác. Do đó, số lượng tế bào thích hợp nhất để sinh thiết có thể là 5‐10 tế bào thay vì 1‐5 tế bào. Nhìn chung, việc sử dụng các kỹ thuật xâm lấn này để sinh thiết TE có thể làm giảm 5% tỷ lệ trẻ sinh sống.

·      Khi nào nên thực hiện sinh thiết phôi?
Chưa có kết luận xác đáng nào về thời điểm tốt nhất để sinh thiết phôi. Thời điểm sinh thiết có thể ảnh hưởng đến số lượng tế bào được sinh thiết trên tổng số tế bào phôi. Phương pháp khoan mở ZP ở ngày 3 có thể thúc đẩy quá trình nở trong phôi nang giai đoạn đầu (khoảng 40‐60 tế bào). Trong khi đó, việc mở ZP trong giai đoạn phôi nang đang phát triển (khoảng 60-100 tế bào) giúp số lượng tế bào thoát ra ít hơn, tránh thất thoát vật liệu di truyền trong quá trình lấy tế bào. Goossens và cộng sự (2008) đã báo cáo rằng việc loại bỏ một hoặc hai phôi bào trong giai đoạn phôi phân chia có ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của phôi vào ngày 5. Cụ thể, loại bỏ từ 5 đến 10 tế bào TE bằng cách sinh thiết phôi nang đã nở rộng (có số lượng tế bào nhiều) sẽ ít xâm lấn hơn so với phôi nang giai đoạn đầu (có số lượng tế bào ít hơn). Trên thực tế, nên thực hiện sinh thiết TE khi các phôi nang đạt kích thước đầy đủ (> 160 µm) bằng phương pháp khoan ZP [7] vì không có cách nào để đánh giá tổng số tế bào.

Các kết quả nghiên cứu lâm sàng cho thấy phôi nang có tốc độ phát triển nhanh hơn sẽ cho kết quả mang thai lâm sàng và tỷ lệ sinh sống tốt hơn. Ngược lại, các phôi nang kích thước nhỏ hơn (<160 µm) vào ngày thứ 7 ít có cơ hội đi đến kết cục thai lâm sàng hơn. Do đó, thời điểm tốt để sinh thiết phôi có thể là khi phôi nang đã phát triển hoặc đang phát triển và có số lượng tế bào lớn. Ngoài ra, nếu phôi có tốc độ phát triển sớm hơn, chẳng hạn như phôi nang đã phát triển vào ngày thứ 5, thì sẽ mang lại kết quả tốt hơn.

·      Kích thước điểm mở ZP và độ dài thời gian thực hiện sinh thiết?
Nói chung, sinh thiết TE nên được thực hiện trong vòng 3 phút. Tuy nhiên, các mẫu tế bào TE dày có thể khó tách ra khỏi phôi nang. Việc làm giãn vùng TE của mặt phẳng cắt giúp sinh thiết ít khó khăn hơn. Ngoài ra, việc dùng laser tạo ra các lỗ nhỏ hơn có thể giúp sinh thiết dễ dàng hơn. Tuy nhiên, quá trình này có thể phức tạp hơn, nếu bỏ qua thời điểm tối ưu để sinh thiết. Nếu vị trí mở lớn có thể đưa đến hiện tượng phôi thoát ra thành hình số 8, khiến phôi khó nguyên vẹn và có thể thoát ra khỏi ZP. Thêm vào đó, kích thước của pipet hút tế bào TE có thể được thay đổi nhằm giảm thiểu diện tích của mặt phẳng cắt. Hiện tại, trên thị trường ngày càng có thêm nhiều loại pipet hút có đường kính trong 20‐40 μm, giúp quá trình sinh thiết phôi được thuận tiện hơn.

·      Kỹ thuật sinh thiết TE bằng cách có hỗ trợ laser hoặc cơ học
Sử dụng tia laser không tiếp xúc trong quá trình cắt thu tế bào TE giúp rút ngắn thời gian sinh thiết TE. Tuy nhiên, những nhược điểm tiềm ẩn của phương pháp này vẫn chưa được làm rõ, chẳng hạn như sự khuếch tán nhiệt liệu có ảnh hưởng đến các tế bào phôi hiện vẫn chưa được xác định.

Vậy câu hỏi đặt ra là sinh thiết được hỗ trợ bằng laser có tạo ra những thay đổi đối với các tế bào được sinh thiết không? Tại hội nghị thường niên của Hội Y học Sinh sản Hoa Kỳ (ASRM) năm 2017, Kelka và cộng sự đã kết luận rằng sinh thiết tế bào TE hỗ trợ bằng laser (TEB) không có tác động đến cấu trúc DNA. Trái lại, Hội Phôi học và Sinh sản người Châu Âu (ESHRE) năm 2019 lại kết luận rằng sử dụng laser có thể làm tăng nguy cơ khảm. Cần có thêm nhiều nghiên cứu nhằm đánh giá và khẳng định liệu phương pháp sinh thiết sử dụng laser hỗ trợ có ưu việt hơn phương pháp cơ học hay không.

·      Quy trình rửa tế bào sau khi sinh thiết
Các dữ liệu cho thấy nếu các mẫu TE được sinh thiết bị nhiễm DNA ngoại lai có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Do đó, phải cẩn thận khi thực hiện rửa tế bào sau sinh thiết nhằm tránh hiện tượng nhiễm. Ngoài ra, việc lấy lại các tế bào TE bị phân mảnh cũng có thể làm ảnh hưởng đến kết quả sinh thiết. Vì vậy, nên tránh hút các tế bào TE bị phân mảnh trong quá trình sinh thiết.

·      Thời điểm bảo quản lạnh sau sinh thiết TE
Có hai chiến lược chuyển phôi sau sinh thiết hiện đang được áp dụng trong thực hành lâm sàng là chuyển phôi trữ hoặc chuyển phôi tươi. Sinh thiết phôi bào vào ngày 3 cho kết quả sàng lọc nhanh trước ngày 5 và có thể chuyển phôi tươi ngày 5 cho bệnh nhân. Tuy nhiên, việc sinh thiết TE và chuyển phôi đông lạnh đang là xu hướng gia tăng trên toàn thế giới [5]. Thời điểm đông lạnh phôi tối ưu sau sinh thiết TE vẫn còn tranh cãi. Trong một nghiên cứu, thời gian tối ưu được báo cáo là 10‐15 phút [6], trong khi, một nghiên cứu khác báo cáo rằng 30 phút hoặc ít hơn là tối ưu [7]. Ngược lại, một báo cáo khác cho thấy thời gian tối ưu là > 3 giờ để phôi có thể phục hồi sau sinh thiết [8]. Trong một số nghiên cứu thử nghiệm, hầu hết các phôi nang được đông lạnh trong vòng 30 phút sau khi sinh thiết TE, cho tỷ lệ mang thai lâm sàng cao trên mỗi lần chuyển phôi [9]. Tuy nhiên, cần thêm các nghiên cứu bổ sung để làm rõ phác đồ tối ưu.

III.         Kết luận
Hiện nay, trong khi hiệu quả của xét nghiệm di truyền tiền làm tổ vẫn còn gây tranh cãi thì vấn đề tối ưu hoá các quy trình liên quan đến sinh thiết phôi là rất quan trọng, giúp làm tăng độ tin cậy của phương pháp này, cũng như giảm thiểu tác động xấu đến phôi. Các yếu tố khác như độ chính xác phương pháp chẩn đoán di truyền, quy trình sinh thiết, rửa tế bào, … đều ảnh hưởng đến kết quả sinh thiết. Phương pháp sinh thiết TE tuy được sử dụng phổ biến nhưng vẫn chưa được thống nhất trong quy trình sinh thiết tiêu chuẩn giữa các trung tâm. Vì vậy, cần thêm những nghiên cứu giúp tối ưu hoá các kỹ thuật sinh thiết, tạo điều kiện hỗ trợ tốt hơn cho những tiến bộ trong sinh thiết di truyền phôi tương lai.
 
Tài liệu tham khảo
1. Capalbo A, Rienzi L, Cimadomo D, et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Hum Reprod. 2014;29(6):1173-1181. Epub 2014/03/01
2. Capalbo  A, Ubaldi  FM, Cimadomo  D, et  al. Consistent  and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Hum Reprod. 2016;31(1):199-208. Epub 2015/12/08
3. Gu  YF, Zhou QW,  Zhang SP, et al. Inner  cell mass  incarceration in 8-shaped blastocysts does not increase monozygotic twinning in preimplantation genetic diagnosis and screening patients. PLoS ONE. 2018;13(1):e0190776. Epub 2018/01/10
4. Iwasawa  T,  Takahashi  K,  Goto  M,  et  al.  Human  frozen-thawed blastocyst morphokinetics observed using time-lapse cinematography reflects the number of trophectoderm cells. PLoS ONE. 2019;14(1):e0210992. Epub 2019/01/17
5. Cimadomo D, Soscia D, Vaiarelli A, et al. Looking  past  the  appearance: a comprehensive description of the clinical contribution of poor-quality blastocysts to increase live birth rates during cycles with aneuploidy testing. Hum Reprod. 2019;3 4(7):1206-1214. Epub 2019/06/28
6. Reed  ML,  Said  AH,  Thompson  DJ,  et  al.  Large-volume  vitrification of human biopsied and non-biopsied blastocysts: a simple, robust technique for cryopreservation. J Assist Reprod Genet. 2015;32(2):207-214. Epub 2014/12/04.
7. Cimadomo D, Capalbo  A,  Levi-Set ti PE, et  al. Associations  of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Hum Reprod. 2018;33(11):1992-20 01. Epub 2018/09/29
8. Chen HH , Huang CC , Cheng EH , et al. Optimal timing of blastocyst vitrification after trophectoderm biopsy for preimplantation genetic screening. PLoS ONE. 2017;12(10):e 0185747. Epub 2 017/10/06
9. Aoyama N, Kato K. Trophectoderm biopsy for preimplantation genetic test and technical tips: a review. Reprod Med Biol. 2020;00:1–10. https://doi.org/10.1002/rmb2.12318.

Từ khóa: NHỮNG VẤN ĐỀ LIÊN QUAN ĐẾN KỸ THUẬT SINH THIẾT PHÔI