Các ứng dụng lâm sàng của trữ lạnh noãn bao gồm bảo tồn khả năng sinh sản của những bệnh nhân ung thư đang điều trị bằng hóa trị và xạ trị, thay thế trữ lạnh phôi để tránh các vấn đề liên quan đến pháp lý và đạo đức, kéo dài độ tuổi sinh sản và bảo tồn các loài có nguy cơ tuyệt chủng. Các đặc tính bảo vệ trong điều kiện đông lạnh của glycerol và dimethylsulfoxide (Me₂SO) đã được chứng minh là góp phần cho sự thành công trong phương pháp trữ lạnh ở nhiều loại tế bào, tuy nhiên trữ lạnh noãn của động vật có vú gặp phải khó khăn do sự hình thành các tinh thể băng nội bào (IIF), ly giải tế bào, độc tính hóa học của các chất bảo vệ đông lạnh (CPA), mất cân bằng áp suất thẩm thấu (osmotic stress), phá vỡ bộ khung xương tế bào và vi ống trục chính, xuất bào sớm của hạt vỏ và làm cứng zona, trinh sản, và đa bội. Thông qua những nỗ lực nghiên cứu chuyên sâu để giảm thiểu những tổn thương của noãn do quá trình trữ lạnh, các kết quả ngày càng cải thiện được báo cáo với cả 2 phương pháp đông lạnh chậm và thủy tinh hóa. Phương pháp thủy tinh hóa yêu cầu thể tích mẫu tối thiểu (dưới 1 μl), nồng độ CPA thẩm thấu thấp (~30%) và tốc độ làm lạnh/làm ấm cực nhanh mang lại kết quả có thể chấp nhận được về mặt lâm sàng và hiện là phương pháp thường được lựa chọn để trữ noãn ở người, tuy nhiên phương pháp này dễ gặp các vấn đề về thao tác xử lý cũng như có nguy cơ lây nhiễm các mầm bệnh. Ngược lại, phương pháp đông lạnh chậm thường không có các rủi ro an toàn sinh học; tuy nhiên, tỷ lệ thành công của phương pháp này thấp hơn so với thủy tinh hóa. Hiểu rõ hơn về cơ chế gây tổn thương noãn khi trữ lạnh có thể giúp khắc phục những thiếu sót của các phương pháp hiện tại từ đó phát triển các phương pháp an toàn và đáng tin cậy hơn để trữ lạnh noãn.

Mặc dù có thể dễ dàng nhận ra các tổn thương lạnh gây thoái hóa noãn như IIF và ly giải tế bào, nhưng các tổn thương không gây thoái hóa cũng có thể xảy ra, chẳng hạn như tổn thương DNA, thay đổi biểu hiện gen hoặc chức năng protein bị thay đổi và những tổn thương này không rõ ràng ngay lập tức. Trên thực tế, một số lượng đáng kể các noãn trữ lạnh thường không thể thụ tinh và phát triển tiếp tục mặc dù có hình thái bình thường sau khi rã đông và đưa về nhiệt độ sinh lý. Hiểu được những tác động lên biểu hiện gen của phôi có thể giúp hiểu rõ hơn về một số tổn thương bên trong và suy giảm khả năng phát triển liên quan. Các nghiên cứu trước đây đã khảo sát tác động của việc trữ lạnh noãn đối với quá trình phiên mã hoặc các gen chọn lọc và kết quả cho thấy mức mRNA đã thay đổi đáng kể.

Mục tiêu của nghiên cứu này là điều tra ảnh hưởng của trữ lạnh noãn lên quá trình phiên mã của phôi sau khi hoạt hóa bộ gen phôi (embryonic genome activation –EGA). Phương pháp trữ lạnh chậm được sử dụng trong nghiên cứu này vì phương pháp này gây ra nhiều tổn thương đáng kể hơn so với thủy tinh hóa từ đó cho ra những kết quả đa dạng hơn bao gồm cả những tổn thương bên trong. Noãn chuột ở giai đoạn giảm phân II (MII) được trữ lạnh và rã đông bằng phương pháp đông lạnh chậm, được thụ tinh và so sánh với phôi đối chứng ở giai đoạn bốn tế bào bằng phương pháp microarrays (Hình 1). Các phương pháp tin sinh học như Ingenuity Pathway Analysis (IPA), Functional Annotation, PPI Network Analysis and Hub Gene Identification đã được sử dụng để tìm hiểu về các con đường khắc phục những tổn thương do bảo quản lạnh gây ra. Các kết quả được báo cáo cho thấy những tác động đáng kể của việc trữ lạnh noãn đối với biểu hiện gen của phôi có thể ảnh hưởng đến tiềm năng phát triển của phôi. Những hiệu ứng này cung cấp các dấu ấn sinh học mới có thể hỗ trợ cải thiện phương pháp trữ lạnh noãn bào.


Kết quả: Kết quả của những tổn thương sau trữ lạnh kéo dài đối với hoạt động phiên mã là 305 gen biểu hiện đã bị thay đổi, trong đó có 200 gen được điều hòa tăng và 105 gen được điều hòa giảm. Những gen này liên quan đến 5 chức năng chính: điều chỉnh chức năng của ty thể, chuyển hóa và điều hòa protein, phản ứng của tế bào đối với trạng thái stress và oxy hóa, điều hòa/chuyển hóa axit béo và lipid, duy trì chu kỳ tế bào. Ngoài ra, tác giả đã xác định được 19 gen Hub trong danh sách các gen biểu hiện khác biệt (differentially expressed genes –DEG) từ phân tích Cytoscape và 120 gen điều hòa vùng ngược hướng (upstream) IPA bị ảnh hưởng đáng kể, trong đó có 10 gen tự biểu hiện khác biệt.

Hiệu quả trữ lạnh noãn có thể được cải thiện khi hiểu rõ ảnh hưởng của việc trữ lạnh và những tổn thương của noãn trong giai đoạn kích hoạt bộ gen phôi (EGA) và điều chỉnh sự biểu hiện gen sau đó. Bộ gen noãn bào trải qua quá trình chỉnh sửa trước khi vào quá trình giảm phân, là một phần trong quá trình ngừng phiên mã và điều chỉnh việc cung cấp các protein mã hóa nhân ty thể và hoạt động của ty thể. Thực tế, có một loạt các hoạt động kích hoạt bộ gen xảy ra trong phôi chuột. Hoạt động phiên mã thứ nhất (EGA1) xảy ra ngay sau lần phân chia đầu tiên, phần lớn được điều hòa bởi các yếu tố từ noãn như DPPA2 và DPPA4 hoạt hóa biểu hiện của DUX, và sau đó là ZSCAN4 và các gen EGA1 khác. EGA1 sẽ chấm dứt trong vòng vài giờ thông qua hoạt động của SMCHD1 và một ligase E3. Hoạt động phiên mã tiếp theo (EGA2) là sự kiện hoạt hóa chính, với hàng nghìn gen được cảm ứng. Sau đó, EGA3 xảy ra ở giai đoạn 8 tế bào, do đó giai đoạn 4 tế bào (giữa EGA2 và EGA3) được tác giả phân tích vì ở giai đoạn này sự biểu hiện gen tương đối ít thay đổi. Nhiều quá trình thiết yếu làm nền tảng cho quá trình trên, bao gồm nguyên phân, phân chia tế bào, điều hòa trao đổi chất và điều chỉnh chính xác sự toàn vẹn và chức năng của màng tế bào. Pha S đầu tiên có vai trò trong việc khởi đầu sự phiên mã, pha S thứ hai thiết lập trạng thái dừng phiên mã; từ đó phôi có những khả năng cơ bản để điều chỉnh phiên mã gen. Bởi vì các hoạt động ban đầu của các yếu tố biểu hiện phiên mã ở noãn như SMCHD1 tác động đến sự biểu hiện gen và các quá trình phát triển trong các giai đoạn phân chia sau đó nên những tổn thương sau trữ lạnh noãn có thể gây ra những ảnh hưởng lâu dài đến nhiều quá trình khác nhau. Một số ảnh hưởng từ những tổn thương khi trữ noãn đã được ghi nhận gồm ảnh hưởng đến chức năng của ty thể, chức năng và tính toàn vẹn màng tế bào, sự phân chia tế bào, chuyển hóa protein và các con đường tín hiệu.

Kết luận, trữ lạnh noãn gây ra những tổn thương lâu dài cho noãn điều này ảnh hưởng đến biểu hiện gen của phôi thai, được đặc trưng bởi các con đường điều hòa lên và xuống (upregulated and downregulated pathways). Những phát hiện này cho thấy có những tác động chưa được công nhận trước đây của việc đông lạnh chậm đối với biểu hiện gen của phôi. Giải quyết những tác động tổn thương liên quan đến đông lạnh này có thể hỗ trợ cải tiến các phương pháp trữ lạnh noãn bào.

Nguồn: Eroglu B, Szurek EA, Schall P, Latham KE, Eroglu A (2020) Probing lasting cryoinjuries to oocyte-embryo transcriptome. PLOS ONE 15(4): e0231108.

Từ khóa: Tìm hiểu về những ảnh hưởng của sự tổn thương noãn sau trữ lạnh đến quá trình phiên mã noãn - phôi