Xét nghiệm di truyền tiền làm tổ sàng lọc phôi lệch bội (PGT-A) bằng cách sinh thiết các tế bào lá nuôi (TE) và giải trình tự thế hệ mới (next generation sequencing - NGS) đã làm cải thiện đáng kể tỷ lệ mang thai diễn tiến trên mỗi lần chuyển, giảm đa thai bằng cách chuyển đơn phôi nguyên bội, giảm tỷ lệ sẩy thai và nguy cơ mang thai lệch bội. Tuy nhiên, có ba thách thức chính của PGT-A hiện tại là (i) sinh thiết TE tốn nhiều công sức, (ii) sinh thiết TE có xâm lấn và (iii) mẫu TE được lấy có thể bị sai lệch và không đại diện chính xác cho khối tế bào bên trong (ICM) và phần còn lại của TE. Hơn nữa, mặc dù không có báo cáo về gia tăng nguy cơ bất lợi lên kết quả chu sinh, chẳng hạn như sinh non và nhẹ cân, các kết quả về sức khỏe dài hạn của trẻ sau sinh thiết phôi có xâm lấn sẽ mất khoảng thời gian dài để lấy.

Gần đây DNA tự do của phôi (cell-free embryonic DNA - cfeDNA) đã được tìm thấy trong cả dịch khoang phôi và môi trường nuôi cấy phôi đã qua sử dụng. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng xét nghiệm cfeDNA sử dụng môi trường đã nuôi cấy phôi vào ngày 5 hoặc ngày 6 có khả năng phát hiện thể lệch bội nhiễm sắc thể và các rối loạn đơn gen. Xét nghiệm di truyền tiền làm tổ không xâm lấn (niPGT) hoặc xét nghiệm di truyền tiền làm tổ xâm lấn tối thiểu (miPGT) bằng cách sử dụng cfeDNA từ môi trường đã nuôi cấy phôi (Spent Embryo culture Medium- SEM) và/hoặc dịch khoang phôi (Blastocoel Fluid- BF) có khả năng thay thế phương pháp PGT-A hiện tại do tránh được các rủi ro tiềm ẩn liên quan đến việc xâm lấn phôi. Hơn nữa, niPGT/miPGT cũng tiết kiệm chi phí hơn. niPGT-A dựa trên trình tự của cfeDNA có khả năng được giải phóng từ cả TE và ICM nên có thể đại diện tốt hơn cho toàn bộ phôi so với chỉ sinh thiết TE.

Hiện nay, có ba phương pháp tiếp cận nghiên cứu chính liên quan đến cách thu thập cfeDNA để kiểm tra thể lệch bội:

1. Hút dịch khoang phôi bằng pipette ICSI (BF)
2. Môi trường đã nuôi cấy phôi đơn phôi (SEM)
3. Thu nhận kết hợp môi trường đã nuôi cấy phôi với dịch khoang phôi (SEM+ BF) mà không cần hút dịch khoang phôi.

Độ chính xác của phương pháp niPGT có thể bị ảnh hưởng bởi một vài yếu tố gồm sự có mặt của tế bào cumulus và corona từ người mẹ, thoái hóa cfeDNA, lượng cfeDNA thấp, hiệu quả và khả năng khuếch đại DNA thay đổi và các đoạn DNA bị phân mảnh.

Tỷ lệ kết quả tương đồng cao giữa niPGT-A và sinh thiết TE cũng như giữa niPGT-A và toàn bộ phôi nang đã được báo cáo bởi một số nhóm nghiên cứu. Tuy nhiên, có một số vấn đề rất quan trọng cần được giải quyết trước khi áp dụng thường quy niPGT như giảm thiểu nguy cơ xuất hiện DNA của mẹ, xác định các yếu tố ảnh hưởng đến độ chính xác và tối ưu hóa quy trình khuếch đại toàn bộ bộ gen (whole genome amplification – WGA) cho cfeDNA.

Kuznyetsov đã tiến hành nghiên cứu nhằm đánh giá độ chính xác và độ tin cậy của việc sử dụng cfeDNA trong các mẫu SEM+ BF để phát hiện tình trạng nhiễm sắc thể của phôi bào so với các mẫu sinh thiết TE tương ứng trong một nhóm phôi tươi nuôi cấy lớn hơn so với công bố trước đây của nhóm. Các tác giả còn đánh giá thêm một số yếu tố quan trọng có thể ảnh hưởng đến phương pháp này, bao gồm (i) số lượng cfeDNA khuếch đại thu được, (ii) ảnh hưởng của các cấp hình thái phôi nang lên cfeDNA (iii) kích thước trung bình của các đoạn WGA-DNA phân mảnh từ phôi nang chất lượng tốt và trung bình/thấp, và (iv) khuếch đại toàn bộ bộ gen của cfeDNA từ các mẫu SEM+ BF có hoặc không có bước ly giải/chiết xuất tế bào.

Gần đây, có báo cáo ra rằng chỉ có khoảng 8% DNA trong môi trường nuôi cấy có nguồn gốc từ phôi, do đó có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích của nhóm tác giả. Từ báo cáo trên, để giảm thiểu sự xuất hiện DNA từ người mẹ, tác giả đã sửa đổi các bước quy trình từ ngày 0 đến ngày 4 của quá trình nuôi cấy phôi bao gồm loại bỏ cẩn thận các tế bào corona còn sót lại bằng cách dùng pipet và rửa sạch. Sử dụng trình tự lặp lại ngắn (STR) được đánh dấu huỳnh quang để phân tích cả DNA phôi (tế bào TE) và mẫu miPGT, tác giả xác nhận bước này giảm thiểu nguy cơ nhiễu từ mẹ. Ngoài ra, vào ngày thứ 4, phôi sẽ được cấy đơn vào từng giọt môi trường mới và sử dụng các mẫu SEM+ BF thu được sau nuôi cấy ngày 5/6, điều này làm cho cfeDNA ít bị phân hủy và thu được lượng cfeDNA nhiều hơn. Quy trình này cũng được áp dụng trong hai nghiên cứu gần đây cho thấy tính hiệu quả so với PGT-A không xâm lấn, các mẫu được thu nhận từ thời gian nuôi cấy kéo dài có khả năng dẫn đến mẫu cfeDNA bị phân hủy nhiều hơn.

Vấn đề liệu các axit nucleic có thể xuyên qua zona pellucida hay không vẫn là một câu hỏi chưa được giải đáp. Tác giả giả thuyết rằng hỗ trợ thoát màng (AH) có thể tạo điều kiện cho cfeDNA trọng lượng phân tử cao từ BF giải phóng vào môi trường nuôi cấy. Trong các nghiên cứu này, AH được thực hiện vào ngày thứ 4 và một số nhà nghiên cứu khác đã AH vào ngày thứ 3 hoặc không AH trước khi tiến hành sinh thiết TE. Ho và cộng sự 2018 nhận thấy rằng AH vào ngày thứ 3 không ảnh hưởng đến nồng độ cfeDNA hoặc độ chính xác của việc xác định trình tự cfeDNA để sàng lọc thể lệch bội. CfeDNA được phân lập từ môi trường nuôi cấy phôi vào ngày 2/3 có trọng lượng phân tử thấp, trong đó sự phân mảnh tế bào cũng có thể đóng một vai trò nhất định. Vera-Rodriguez và cộng sự chỉ ra rằng các mẫu được phân lập từ môi trường đã nuôi cấy phôi có thể chứa DNA trọng lượng phân tử cao hoặc DNA đã cắt nhỏ.

Cơ chế của việc phóng thích DNA của phôi vào môi trường nuôi cấy vẫn chưa rõ ràng và nguồn gốc của những đoạn DNA này vẫn chưa được biết rõ. Giả thuyết phổ biến nhất là các đoạn DNA có kích thước nucleosome (~180–200 bp) đang được giải phóng khỏi tế bào do kết quả của quá trình apoptosis, các đoạn DNA có kích thước dài hơn được giải phóng do cơ chế hoại tử.

Các nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng nồng độ cfeDNA tương quan với các quá trình apoptosis của phôi bào. Tác giả đưa ra giả thuyết rằng các phôi bào cấp thấp hơn, có xu hướng chết theo chương trình nhiều hơn, sẽ giải phóng một lượng cfeDNA nhiều hơn vào môi trường. Gần đây Ho và cộng sự nhận thấy rằng hình thái phôi nang không ảnh hưởng đến nồng độ cfeDNA trong môi trường nuôi cấy hoặc độ chính xác để sàng lọc thể lệch bội.

Thông qua việc sử dụng môi trường nuôi cấy phôi kết hợp với dịch khoang phôi nang, nhiều bằng chứng đã cho thấy rằng cấp hình thái của phôi nang không ảnh hưởng đến tỷ lệ kết quả NGS thông tin từ cfeDNA. Lượng DNA khuếch đại từ phôi nang chất lượng tốt thấp hơn một chút so với phôi nang chất lượng trung bình/thấp, tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Tỷ lệ phù hợp trên mỗi mẫu đối với số lượng bản sao toàn bộ nhiễm sắc thể giữa các mẫu sinh thiết miPGT và TE đối với cả phôi nang chất lượng tốt và trung bình thấp, không khác biệt về mặt thống kê. Kích thước trung bình của các đoạn WGA-DNA thu được từ các mẫu miPGT từ phôi nang chất lượng tốt và từ phôi nang chất lượng trung bình/thấp không khác biệt về mặt thống kê.

Quá trình apoptosis của tế bào có thể không phải là cơ chế duy nhất để giải phóng DNA từ ICM và TE vào BF và SEM. Có nhiều giả thuyết khác về các cơ chế giải phóng DNA của phôi. Một khả năng là DNA của phôi trong môi trường nuôi cấy có thể bắt nguồn từ các tế bào bị hư hỏng do xung laser được sử dụng trong quá trình làm co phôi nhân tạo. MicroDNAs ngoài nhiễm sắc thể cũng có thể là nguồn cfeDNA trong môi trường nuôi cấy đã qua sử dụng. Sự sản xuất các microDNA này là một phần của sinh lý tế bào bình thường và có liên quan đến hoạt động phiên mã và sửa chữa không phù hợp. Các microDNA ngoài nhiễm sắc thể có kích thước thay đổi từ 60 đến 2000 cặp bazơ. Chúng có nhiều trong tất cả các loại mô của tế bào động vật có vú, bao gồm cả tinh trùng. Các túi ngoại bào (EVs) trong dịch khoang phôi và môi trường nuôi cấy phôi như một phương tiện vận chuyển có thể chứa DNA để truyền thông tin giữa các tế bào TE và ICM. Trao đổi chéo tương tự bằng các EVs giúp vận chuyển các miRNA và các phân tử khác (mRNA, DNA, lipid và protein) đã được mô tả giữa các tế bào. Gần đây các tác giả cũng đã báo cáo rằng EVs dường như có thể đi qua zona pellucida khi phôi người được nuôi cấy trong ống nghiệm, điều này ủng hộ giả thuyết vừa nêu trên.

Vì cfeDNA bao gồm các đoạn DNA tương đối ngắn, nên việc phân tích môi trường nuôi cấy đã qua sử dụng đòi hỏi các sửa đổi trong quy trình khuếch đại toàn bộ tiêu chuẩn. Ở đây tác giả cho thấy rằng các mẫu miPGT-1 và miPGT-2 có tỷ lệ tương đồng cao tương tự với các mẫu sinh thiết TE tương. Như vậy, việc khuếch đại cfeDNA mà không sử dụng bước DNA ly giải/chiết tách tế bào có khả năng làm giảm nguy cơ nhiễu từ mẹ đối với các mẫu niPGT/miPGT bởi các tế bào cumulus và corona còn sót lại.

Nhóm tác giả kết luận rằng độ chính xác của miPGT không liên quan đến cấp hình thái phôi nang. Tỷ lệ phù hợp tổng thể trên mỗi mẫu về tình trạng nguyên bội/lệch bội giữa các mẫu sinh thiết miPGT-A và TE là 88/90 (97,8%), và không khác biệt giữa các phôi nang chất lượng tốt 47/48 (97,9%) và trung bình/thấp 41/42 (97,9%) (p> 0,05). Quan trọng hơn, phương pháp khuếch đại toàn bộ bộ gen (WGA) của SurePlex có thể được sử dụng phân tích cfeDNA mà không cần thêm bước tách/chiết DNA tế bào; điều này có thể làm giảm nguy cơ gây nhiễu từ mẹ. Về nguồn gốc của cfeDNA, lượng WGA-DNA miPGT-A trung bình thu được từ phôi nang với các cấp hình thái khác nhau, cũng như kích thước các đoạn WGA-DNA phân mảnh, cho thấy rằng quá trình apoptosis và hoại tử không phải là cơ chế duy nhất giải phóng DNA từ ICM và TE vào BF và SEM.
Kết quả nghiên cứu này cho thấy miPGT-A sử dụng kết hợp dịch khoang phôi và môi trường nuôi cấy phôi có tiềm năng vượt trội hơn so với sinh thiết TE đơn thuần và có thể được ứng dụng lâm sàng thường quy trong tương lai.

Nguồn: Kuznyetsov, Valeriy, et al. "Minimally Invasive Cell-Free Human Embryo Aneuploidy Testing (miPGT-A) Utilizing Combined Spent Embryo Culture Medium and Blastocoel Fluid–Towards Development of a Clinical Assay." Scientific Reports 10.1 (2020): 1-12.

Từ khóa: Xét nghiệm di truyền tiền làm tổ xâm lấn tối thiểu (miPGT-A) sử dụng môi trường nuôi cấy phôi kết hợp với dịch khoang phôi – Hướng đến phát triển ứng dụng trên lâm sàng