Kể từ khi phát hiện ra cell-free fetal DNA, tạm dịch là ADN tự do của thai (cffDNA) trong huyết tương của người mẹ vào năm 1997, đã có rất nhiều tiến bộ trong việc tận dụng cffDNA làm nguồn vật liệu di truyền của thai trong chẩn đoán tiền sản.
Phần lớn ADN tự do có nguồn gốc từ người mẹ; ADN tự do của thai (cffDNA) có nguồn gốc từ nhau được phát hiện trong máu mẹ từ khoảng tuần thứ 5 của thai kỳ và chiếm khoảng 10% tổng số ADN tự do vào đầu thai kỳ. Tuy nhiên, vì cffDNA sẽ nhanh chóng bị loại khỏi máu mẹ sau khi sanh, nó đem lại tiềm năng lớn trong việc trở thành một nguồn vật liệu di truyền của thai để chẩn đoán tiền sản.
Ban đầu, với số lượng lớn ADN tự do của mẹ, những hạn chế về kỹ thuật chỉ giúp chúng ta phát hiện hoặc loại trừ các alen không hiện diện ở mẹ nhưng hiện diện ở thai, bởi vì chúng được di truyền từ bố hoặc mới phát sinh lúc thụ thai. Như vậy, chỉ định ban đầu là để xác định giới tính thai nhi bằng cách sử dụng alen trên nhiễm sắc thể Y, kiểu gen Rhesus D (RhD) của thai nhi ở các bà mẹ RhD âm tính, hoặc để chẩn đoán một số bệnh di truyền nhất định, chẳng hạn như chứng loạn sản sụn, trong đó phần lớn các trường hợp là kết quả của một đột biến mới.
Những tiến bộ về kỹ thuật đã giúp giải trình tự chính xác các ADN có liên quan đến những nhiễm sắc thể riêng biệt, hiện diện trong máu của người mẹ. Điều đó cho phép xét nghiệm tiền sản không xâm lấn (non-invasive prenatal testing - NIPT) nhằm phát hiện thể dị bội phát triển rất nhanh chóng. Hơn nữa, định lượng cffDNA cũng có thể hữu ích trong giai đoạn sớm ở những thai kỳ có nguy cơ kết cục xấu, như tiền sản giật và chậm tăng trưởng thai. Những phát triển này tạo ra những thay đổi lớn nhất từ trước đến nay trong chăm sóc tiền sản trong vài thập kỷ qua vì nó làm cho nhu cầu xét nghiệm chẩn đoán xâm lấn giảm xuống đáng kể.

I.  Rối loạn liên kết nhiễm sắc thể X và các rối loạn không xác định rõ giới tính
Ứng dụng sớm nhất của cffDNA trên lâm sàng là để xác định giới tính thai nhi, dựa trên việc phát hiện trình tự SRY hoặc DYS14 có nguồn gốc từ nhiễm sắc thể Y trong huyết tương của mẹ. Kỹ thuật này đã được đưa vào chương trình chăm sóc tiêu chuẩn ở một số nước châu Âu, trong đó có Anh, nhằm quản lý những thai kỳ có nguy cơ bị rối loạn di truyền liên kết với nhiễm sắc thể X, như bệnh nhược cơ Duchenne. Nó có khả năng làm giảm tỷ lệ các xét nghiệm xâm lấn lên đến 50% bằng cách cho phép thực hiện các xét nghiệm có mục tiêu ở những thai là nam. Ở những thai kỳ có nguy cơ tăng sinh tuyến thượng thận bẩm sinh, việc xác định giới tính thai có thể cho phép chấm dứt sớm điều trị steroid ở những thai là nam. Ở một số trung tâm, điều trị steroid có thể được trì hoãn cho đến khi giới tính thai nhi được xác định thông qua thử nghiệm cffDNA sớm và chỉ được dùng steroid ở thai kỳ mà thai nhi được xác định là nữ. Tuy nhiên, xét nghiệm chỉ đáng tin cậy sau 7 tuần mang thai, kết quả dương tính giả có thể gặp đối với sanh đôi hoặc sanh đôi có 1 thai chết ở giai đoạn sớm. Cơ quan sinh dục không xác định rõ ràng là một dấu hiệu hiếm gặp trên siêu âm; ngay cả khi kỹ thuật 3D ra đời và hoàn thiện thì sự phân biệt giữa phì đại âm vật ở thai là nữ và lỗ tiểu đóng thấp ở thai là nam đôi khi vẫn gặp khó khăn. Việc sử dụng cffDNA để xác định giới tính có thể là một trợ giúp rất hữu ích cho siêu âm chẩn đoán một số hội chứng di truyền biểu hiện nhiều dạng bất thường, trong đó thường gặp nhất là bộ phận sinh dục không rõ ràng.

II.  cffDNA và quản lý các biến chứng phát sinh từ kháng nguyên nhóm máu
Ứng dụng lâm sàng thứ hai của xét nghiệm cffDNA là để xác định tình trạng RhD của thai nhi có mẹ RhD âm tính. Cũng giống như việc xác định giới tính thai nhi, điều này là hoàn toàn có thể, bởi vì người mẹ RhD âm tính không sản xuất bất kỳ bản sao gen RhD nào, do đó, các gen RhD tìm thấy trong máu mẹ có nguồn gốc từ thai và được thừa hưởng từ người cha.
Trong thập kỷ qua, việc xác định kiểu gen RhD của thai ở những phụ nữ RhD âm tính với hiệu giá có ý nghĩa kháng thể anti-RhD được tiến hành dựa trên phản ứng chuỗi polymerase (PCR). NIPT giúp tránh được sự cần thiết phải xét nghiệm xâm lấn đã được chỉ định trước đó. Ngoài việc tránh nguy cơ sẩy thai, NIPT giúp chúng ta không cần phải đánh giá kiểu hình của người cha, vì kiểu hình của người cha có thể không được biết hoặc không có sẵn. Nếu thai nhi là RhD dương tính, cần phải tăng cường giám sát ở những trung tâm chuyên khoa để theo dõi sự thiếu máu hoặc phù của thai nhi, trong khi đó nếu thai nhi được dự đoán là RhD âm tính thì không có nguy cơ mắc bệnh tán huyết ở trẻ sơ sinh và chỉ cần chăm sóc tiền sản đúng chuẩn là thích hợp.
Hiện nay, nhiều quốc gia thực hiện chương trình dự phòng tiền sản thường quy cho tất cả các bà mẹ RhD âm tính. Điều này làm giảm đáng kể tần suất tiếp xúc với kháng nguyên Rhesus cho mẹ, nhờ đó các trường hợp dẫn đến thiếu máu thai nhi hiện nay là rất hiếm. Tuy nhiên, kết quả của chương trình này dẫn đến việc tiêm globulin miễn dịch anti-D không cần thiết đối với khoảng 38% phụ nữ RhD âm tính đang mang thai RhD âm tính.
Xác định thường quy kiểu gen RhD của thai nhi và điều trị dự phòng anti-D đã được giới thiệu gần đây vào chương trình chăm sóc sản khoa thường quy đối với thai từ 26-28 tuần cho phụ nữ RhD âm tính tại Hà Lan và Đan Mạch. Tuy nhiên, một nghiên cứu tại Anh đã cho thấy xác định kiểu gen RhD bằng phương pháp xét nghiệm mới, gọi là high-throughput genotyping (tạm dịch là phương pháp xác định gen thông lượng cao), có độ chính xác cao ngay từ tuổi thai 11 tuần. Việc xác định kiểu gen RhD thai nhi ở giai đoạn sớm như vậy của thai kỳ sẽ giúp tránh được việc tiêm anti-D immunoglobulin khi gặp các biến cố nguy cơ (là các biến cố có thể đưa máu thai nhi vào tuần hoàn của mẹ như các thủ thuật xâm lấn: sinh thiết gai nhau, chọc ối, chọc máu cuống rốn hoặc dọa sẩy thai, chấm dứt thai kỳ,…). Từ đó, đã có những khuyến cáo thực hiện việc xác định kiểu gen RhD bằng phương pháp thông lượng cao trong chăm sóc tiền sản tại Anh.
Các chương trình phòng ngừa thường quy hiện nay không đạt được sự chấp nhận hoàn toàn vì một số phụ nữ từ chối điều trị anti-D immunoglobulin. Xác định thường quy kiểu gen RhD của thai có khả năng được chấp nhận cao hơn đối với người phụ nữ và từ đó có thể cải thiện nhận thức về việc phòng ngừa miễn dịch; do đó, tập trung vào những phụ nữ có nguy cơ cao nhất, làm giảm tỷ lệ hình thành miễn dịch và giảm nhu cầu truyền máu cho thai nhi trong tử cung.

III. Xét nghiệm tiền sản không xâm lấn cho các rối loạn đơn gen
Việc sử dụng cffDNA trong việc phát hiện các rối loạn đơn gen gặp nhiều thử thách về mặt kỹ thuật hơn so với xác định kiểu gen RhD thai nhi hoặc xác định giới tính và hiện nay đang được sử dụng trên lâm sàng chỉ để phát hiện các alen được phát sinh mới lúc thụ thai, ví dụ: loạn sản sụn, hoặc các alen được thừa kế từ cha.
Đối với gen lặn hoặc liên kết với nhiễm sắc thể X mà người mẹ cũng mang alen đột biến, số lượng gen nền đột biến của người mẹ hiện diện trong huyết tương của mình cao hơn rất nhiều so với bất kỳ đột biến nào của thai nhi. Do đó, phương pháp dựa vào những khác biệt nhỏ trong tỷ lệ alen đột biến (mutant): alen nguyên thủy (wild-type) được yêu cầu. Ước tính chính xác tỷ lệ này còn phụ thuộc vào tỷ lệ ADN của thai nhi trong huyết tương của người mẹ (fetal fraction) và điều này chỉ có thể được đánh giá một cách hằng định đối với thai là nam, vì nó đòi hỏi việc đo lường alen không có mặt ở mẹ hoặc dựa vào sự khác biệt của quá trình methyl hóa ADN ở thai nhi và mẹ. Độ tin cậy của các phương pháp này khi sử dụng trong thực hành lâm sàng đòi hỏi sự phát triển cũng như đánh giá thêm. Có khả năng phương pháp này sẽ được ứng dụng rộng rãi trong tương lai, bằng cách ứng dụng thực tế là ADN tự do của thai nhi ngắn hơn ADN tự do của mẹ.
Đối với gen lặn, khi mà cha mẹ mang đột biến alen khác nhau, việc loại trừ hoặc phát hiện các alen từ cha có thể được sử dụng để đánh giá nguy cơ cho thai nhi, loại trừ nguy cơ nếu các alen từ cha không được phát hiện trong huyết tương của mẹ và gia tăng nguy cơ nếu các đột biến từ cha được phát hiện. Trong tình huống phát hiện được đột biến từ cha, xét nghiệm xâm lấn là cần thiết để xác định thai nhi có được thừa hưởng alen đột biến từ mẹ hay không. Điều này gần đây đã được báo cáo đối với bệnh thalassemia và bệnh xơ nang. Xác định loạn sản sụn bằng NIPT đã có trong những nghiên cứu từ năm 2007 và đã được chấp thuận cho sử dụng trong thực hành lâm sàng tại Anh vào năm 2012. Xét nghiệm này có thể được thực hiện từ lúc thai được 9 tuần, sớm hơn so với xét nghiệm xâm lấn vốn không thể được thực hiện một cách an toàn cho đến khi thai được 11 tuần, và sớm hơn nhiều so với siêu âm đối với những phụ nữ không muốn chịu nguy cơ của xét nghiệm xâm lấn.
Như vậy, việc sử dụng cffDNA để phát hiện các rối loạn đơn gen có tiềm năng rất lớn. Ở Anh, nó đã được chấp thuận cho sử dụng trong dịch vụ y tế quốc gia để sàng lọc các đột biến gen FGFR3 (chứng loạn sản sụn và loạn sản thanatophoric) và FGFR2 (hội chứng Apert) và để loại trừ đột biến từ cha trong bệnh xơ nang. Với sự ra đời của những xét nghiệm an toàn hơn, chúng ta đang chứng kiến một sự suy giảm đáng kể trong việc sử dụng các xét nghiệm xâm lấn cho các rối loạn đơn gen, khi các xét nghiệm không xâm lấn được phát triển và có hiệu lực.

IV.           Thử nghiệm cffDNA để phát hiện thể dị bội
Sử dụng xét nghiệm ADN tự do để phát hiện thể dị bội đang mang lại sự thay đổi triệt để nhất trong thực hành y khoa nghiên cứu về thai nhi. Mục đích ban đầu của NIPT là để phát hiện hội chứng Down dựa trên định lượng số lượng placenta-specific 4 (PLAC4) trong huyết tương của người mẹ. Gen này bắt nguồn từ nhiễm sắc thể 21, được biểu hiện chỉ trong nhau thai và bắt nguồn từ thai nhi.
Bằng cách phát hiện hai alen riêng biệt với tỉ lệ 1:1, thai nhi có thể được dự đoán là có đủ bộ nhiễm sắc thể (euploid). Nếu có sự nhân lên của một alen (vì thêm một bản sao của nhiễm sắc thể 21), tỷ lệ này sẽ là 2:1 và thai nhi có thể được dự đoán là có 3 nhiễm sắc thể 21. Mặc dù là bước đột phá nhưng cách tiếp cận ban đầu này có nhiều khuyết điểm vì nó đòi hỏi khẳng định sự khác biệt về gen của cha mẹ và chỉ áp dụng trong khoảng 40% trường hợp có thai. Sự ra đời của giải trình tự thế hệ mới (next-generation sequencing: NGS) đã mang đến một cách tiếp cận mới có thể được áp dụng phổ biến. Thay vì phát hiện sản phẩm gen có nguồn gốc từ nhiễm sắc thể 21, tất cả các ADN lưu hành trong huyết tương của người mẹ đều được giải trình tự. Theo định nghĩa, điều này bao gồm cả ADN của mẹ và thai nhi, và giải trình tự sẽ giúp phân tích toàn bộ hệ gen của thai nhi và người mẹ. Kể từ khi các báo cáo đầu tiên mô tả việc sử dụng NGS cho NIPT để phát hiện thể tam bội, tốc độ phát triển của nó đã cực kỳ nhanh chóng và hoàn toàn theo định hướng thương mại. NIPT bây giờ đã có trong khu vực tư nhân tại hơn 50 quốc gia, với tỷ lệ phát hiện vượt quá 99% đối với trisomy 21 và hơi thấp hơn đối với trisomies 18 và 13, lần lượt vào khoảng 96% và 92%. Độ nhạy để phát hiện thể dị bội nhiễm sắc thể giới tính thấp hơn, khoảng 88,6%, với tỷ lệ dương tính giả là 0,12% cho monosomy X.
Sử dụng NIPT để phát hiện thể dị bội đã được chứng minh là một xét nghiệm có hiệu quả cao trong cả thai kỳ nguy cơ cao và nguy cơ thấp. Mặc dù chính xác hơn so với sàng lọc kết hợp thông thường (sử dụng độ mờ da gáy, PAPP-A và hCG) trong tam cá nguyệt 1, NIPT vẫn nên được coi là một thử nghiệm sàng lọc có độ nhạy cao chứ không phải là một thử nghiệm chẩn đoán, và bất kỳ kết quả dương tính nào cũng nên được xác định bởi thử nghiệm xâm lấn, lý tưởng là chọc ối hay ở mức tối thiểu là làm karyotype trên gai nhau nuôi cấy.

Kết luận
Việc sử dụng cffDNA để chẩn đoán về gen và nhiễm sắc thể của thai đang có ảnh hưởng sâu sắc đến lĩnh vực y học nghiên cứu thai nhi trên toàn thế giới. Sự ra đời của NIPT để phát hiện thể dị bội đang làm giảm nhu cầu xét nghiệm xâm lấn. Tỷ lệ đó đã giảm đáng kể ở một số nước. Đây là sự sụt giảm được sự chấp thuận bởi cả người phụ nữ lẫn các chuyên gia sức khỏe vì chúng ta đang hướng về chẩn đoán tiền sản an toàn hơn và sớm hơn.

Từ khóa: CELL-FREE FETAL DNA – Công cụ mới của Y học