CNSH. Lê Thị Quỳnh – IVFMD SIH – Bệnh viện Phụ sản Quốc tế Sài Gòn
 
TỔNG QUAN
Những nỗ lực ban đầu trong việc đông lạnh chậm noãn non, kết hợp tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (Intra-Cytoplasmic Sperm Injection – ICSI), đã mang lại thành công trong thụ tinh và phát triển phôi nang, dẫn đến sinh con khỏe mạnh. Tuy nhiên, sự ra đời của kỹ thuật thủy tinh hóa và rã đông noãn người đã đánh dấu một bước tiến lớn, biến nó thành phương pháp bảo quản lạnh hiệu quả hơn. Sau khi chứng minh sự an toàn và khỏe mạnh của hơn 900 trẻ sơ sinh từ noãn đông lạnh chậm và thủy tinh hóa, cùng với tỷ lệ sống và thụ tinh cao, Hiệp hội Y học Sinh sản Hoa Kỳ (American Society for Reproductive Medicine - ASRM) đã chính thức công nhận đây không còn là phương pháp thử nghiệm vào năm 2012. Quyết định này nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh nhân (BN) nữ ung thư bảo tồn khả năng sinh sản mà không bị ràng buộc bởi các thủ tục đồng ý nghiên cứu phức tạp. Một yếu tố quan trọng dẫn đến sự thay đổi này là bằng chứng cho thấy tỷ lệ bất thường gen ở trẻ sinh ra từ noãn thủy tinh hóa tương đương với trẻ sinh ra từ noãn tươi.
Như các nghiên cứu trước đây đã trình bày, một phương pháp thay thế mới cho thủy tinh hóa thông thường là thủy tinh hóa siêu nhanh (Ultra Fast Vitrification - UFV) kết hợp với quá trình rã đông nhanh (Rapid Elution - RE) có thể đạt được tỷ lệ sống cao nhờ giảm nồng độ chất bảo vệ đông lạnh (Cryoprotective agents – CPA) sau mất nước. Giảm tiếp xúc CPA giúp giảm thiểu tác động độc hại lên màng tế bào và tính thấm chất tan. Tuy nhiên, không thể loại bỏ hoàn toàn CPA nội bào, khiến noãn có nguy cơ giãn nở quá mức và thoái hóa khi cân bằng trong dung dịch rửa đẳng trương.
Các nghiên cứu ban đầu trên mô hình noãn non giai đoạn túi mầm (Giai đoạn 1 và 2) cho thấy noãn xử lý bằng UFV có chức năng trưởng thành và tính toàn vẹn thoi vô sắc tương đương đối chứng tươi. Ngược lại, noãn xử lý bằng thủy tinh hóa thông thường trưởng thành ít hơn ở 24 giờ IVM, gợi ý tác dụng độc hại của việc tiếp xúc CPA kéo dài. Nghiên cứu trên chuột cũng cho thấy UFV có thể ảnh hưởng đến chức năng vi ống và vi sợi, trong khi thủy tinh hóa thông thường làm thay đổi hoạt hóa gen và tổng hợp protein sau rã đông, dẫn đến suy giảm sự phát triển phôi.
Về lý thuyết, UFV giảm tiếp xúc CPA trong tế bào chất, từ đó giảm độc tính bào quan. Mục tiêu của nghiên cứu Giai đoạn 3 là xác minh hiệu quả và độ tin cậy của UFV trên noãn người trưởng thành, khẳng định sự hình thành thoi vô sắc bình thường sau rã đông và xác nhận rằng hoạt hóa noãn nhân tạo (Artificial Oocyte Activation - AOA) có thể thúc đẩy sự hình thành phôi nang bình thường sau UFV/RE.
 
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Ngân hàng noãn có tiêu chí nghiêm ngặt cho noãn trưởng thành bình thường để trữ đông thương mại. Noãn không đạt chuẩn từ chu kỳ kích thích thường bị loại bỏ nhưng được dùng cho đào tạo và nghiên cứu (được ủy ban đạo đức phê duyệt).
Thủy tinh hóa noãn thông thường dùng dung dịch Kitazato DMSO-EG (cân bằng 12 phút) trên Cryotop, rã đông 3 bước trong ≥10 phút (nhóm đối chứng). UFV/RE cân bằng 1 phút (ES)/thủy tinh hóa 1 phút (VS) trên Cryotop, làm lạnh nhanh trực tiếp. Rã đông nhanh trong dung dịch Kitazato 37°C, noãn UFV được xử lý CPA nhanh (1 bước) trước khi bù nước trong môi trường đẳng trương ấm + protein. Tất cả noãn được nuôi cấy trong môi trường một bước trong tủ ấm.
Thiết kế nghiên cứu
Giai đoạn 2: Đánh giá tác động của thủy tinh hóa lên chức năng tế bào bằng cách sử dụng các phương pháp tối ưu từ Giai đoạn 1 trên noãn GV bỏ và noãn đông lạnh hiến tặng. Nghiên cứu tiếp tục đánh giá tính bình thường của thoi vô sắc và sự phát triển đơn tính sau khi thủy tinh hóa (đối chứng tươi, thủy tinh hóa/rã đông đối chứng, UFV/RE).
Thí nghiệm 2: Tại California Fertility Partners và Santa Monica Fertility áp dụng hai phác đồ AOA khác nhau (A23187 +/- DMAP) trên noãn MII sau đó đánh giá sự hình thành tiền nhân và phân chia sau 24 và 48 giờ, và khả năng tạo phôi nang đến Ngày 6.
Giai đoạn 3: Sử dụng noãn trưởng thành không đạt chuẩn từ người hiến tặng để xác định phác đồ AOA tốt nhất cho sự phát triển phôi nang.
Thí nghiệm 1: Một nghiên cứu thí điểm sơ bộ với 40 noãn MII không đạt tiêu chuẩn đã được thực hiện để hỗ trợ thêm cho việc phác đồ AOA nào hỗ trợ tốt nhất cho sự phát triển của phôi nang (20 noãn MII/phương pháp điều trị).
Thí nghiệm 2 và 3: So sánh thủy tinh hóa thông thường/rã đông đối chứng với UFV/RE, sử dụng phác đồ AOA tối ưu (A23187 + 6-DMAP) tại Hanabusa IVF và Santa Monica Fertility, với nhóm đối chứng tươi trong Thí nghiệm 3. Mục tiêu là đánh giá khả năng sống sau rã đông, tính toàn vẹn thoi vô sắc (Thí nghiệm 2), và khả năng phôi phát triển bình thường và phát triển thành phôi nang (Thí nghiệm 3). Thí nghiệm 3 nhắm đến ít nhất 50 noãn MII/nhóm (đối chứng, UFV/RE, thủy tinh hóa thông thường/rã đông đối chứng) để so sánh tỷ lệ phân chia và tạo phôi nang. Tỷ lệ tạo phôi nang tương đương hoặc tốt hơn đối chứng sẽ là tiền đề cho thử nghiệm lâm sàng.
Phân tích ANOVA và kiểm định Tukey HSD được dùng để đánh giá sự khác biệt trong phân tích trục chính. Phân tích chi bình phương được sử dụng để so sánh sự khác biệt về khả năng sống, tỷ lệ trưởng thành và hình thành phôi nang giữa các phương pháp điều trị (thủy tinh hóa thông thường so với UFV). Giá trị P < 0,05 được xem là có ý nghĩa thống kê trong cả hai thử nghiệm.
 
KẾT QUẢ
Tỷ lệ sống trung bình của noãn ở nhóm thủy tinh hóa thông thường thấp hơn đáng kể (70%, P = 0,002) so với nhóm UFV/RE (94%), tương đương nhóm đối chứng (thoái hóa tự phát 4%, P = 0,65). Tỷ lệ trưởng thành bình thường (52-58%) tương đương giữa các nhóm. Không có sự khác biệt về kết quả AOA trong đánh giá tiền nhân (P > 0,5-0,9) hoặc phân chia (P > 0,67-0,87) giữa các nhóm. Tuy nhiên, tỷ lệ hình thành phôi nang chỉ xảy ra ở noãn hoạt hóa bằng DMAP (14,8%). Khi so sánh với đối chứng tươi (hình thành phôi nang cao hơn khi dùng DMAP), sự khác biệt là đáng kể (P = 0,03), ủng hộ việc sử dụng DMAP trong AOA. Xu hướng này được củng cố ở Giai đoạn 3, Thí nghiệm 1 trên noãn trưởng thành tươi, nơi AOA kết hợp DMAP cho tỷ lệ tạo phôi nang cao hơn (33%) so với chỉ dùng A23187 (15,4%, P = 0,29).
Trong Giai đoạn 3, Thí nghiệm 2, tỷ lệ sống của noãn MI sau UFV/RE (100%) cao hơn đáng kể so với nhóm thủy tinh hóa thông thường/pha loãng đối chứng sau 3 và 24 giờ nuôi cấy (giảm từ 90,3% xuống 83,9%, P < 0,05), trong khi nhóm UFV duy trì 100%. Tính toàn vẹn và độ trễ thoi vô sắc tương đương giữa các nhóm, với nhóm UFV đạt 100% tái trùng hợp sau 1 giờ làm ấm. Sự phát triển sau hoạt hóa không khác biệt về tỷ lệ hình thành tiền nhân hoặc phân chia Ngày 3, dù có xu hướng nghiêng về nhóm UFV. Cả hai phương pháp thủy tinh hóa đều tạo ra phôi nang (11%).
Trong Thí nghiệm 3, tỷ lệ sống sau rã đông của noãn MII ở nhóm UFV (100%) cao hơn nhóm thủy tinh hóa thông thường (92,5%, P = 0,04). Sau AOA, cả hai nhóm thủy tinh hóa và nhóm noãn tươi đều phản ứng tốt, với tỷ lệ hình thành tiền nhân cao (≥84%) và tỷ lệ phân chia bình thường (77-79%). Hơn nữa, tỷ lệ tạo phôi nang của cả hai phương pháp thủy tinh hóa (31,7% và 34,9%) đều tương đương và tốt hơn so với noãn tươi sinh sản đơn tính (35,7%). Chất lượng phát triển phôi theo dõi thời gian tương đương giữa hai phương pháp thủy tinh hóa.
 
THẢO LUẬN
Nghiên cứu sử dụng noãn không đạt chuẩn từ ngân hàng noãn để so sánh UFV và thủy tinh hóa thông thường thông qua AOA. Thử nghiệm ban đầu trên noãn GV và noãn trưởng thành IVM cho thấy UFV/AOA với sự phát triển phôi thường dừng ở giai đoạn phân chia, có thể do bất thường nhiễm sắc thể liên quan đến IVM. Nghiên cứu IVM trước đó cho thấy tỷ lệ tạo phôi nang thấp từ noãn thủy tinh hóa. Nghiên cứu hiện tại cũng ghi nhận tỷ lệ tạo phôi nang thấp từ noãn GV thủy tinh hóa, chỉ xảy ra khi ủ với DMAP sau kích thích canxi. Dù noãn GV thủy tinh hóa có thoi vô sắc nguyên vẹn, chúng vẫn dễ tổn thương do các bất ổn tế bào chất liên quan đến IVM.
Thủy tinh hóa truyền thống có nguy cơ gây độc tế bào chất, ức chế hoạt hóa gen và ảnh hưởng đến protein, làm giảm sự phát triển phôi nang. UFV giảm thiểu stress và tổn thương bào quan do tránh hiện tượng co-giãn-co, bảo tồn giải phóng Ca²⁺. Nghiên cứu lâm sàng đang được tiến hành để so sánh kết quả của UFV và thuỷ tinh hoá thông thường trên noãn tươi và noãn hiến tặng đã thủy tinh hóa. Các tác giả tin rằng UFV là giải pháp cho sự không nhất quán trong bảo quản noãn, mang đến lựa chọn tương đương bảo quản phôi.
 
Tài liệu tham khảo: Wozniak et al (2024). Ultra-fast vitrification and rapid elution of human oocytes: Part II–verification of blastocyst development from mature oocytes. Reproductive BioMedicine Online, 49(6), 104690.

Từ khóa: bảo quản lạnh, thuỷ tinh hoá siêu nhanh, rã đông nhanh