BS. Hồ Mạnh Tường

Kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (Assited Reproductive Technology, viết tắt là ART)) bao gồm các kỹ thuật giúp tăng khả năng sinh sản của người. Theo định nghĩa, kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (ART) là những kỹ thuật trong đó có thực hiện đem tế bào trứng người ra khỏi cơ thể. Đây là những kỹ thuật được phát triển cơ bản dựa trên kỹ thuật IVF (in-vitro fertilization) trên người.

Người ta ước tính hiện nay đã có hàng triệu người trên thế giới được sinh ra từ ART. Tại Châu Au, hiện nay có từ 1-5% trẻ sinh ra hàng năm là kết quả của ART. Ở một số nước Bắc Au, hàng năm có gần 2000 trường hợp ART trên 1 triệu dân. ART hiện là một phân ngành quan trọng trong Sản Phụ khoa hiện đại và một bộ phận không thể thiếu ở hầu hết các trung tâm Sản-Phụ khoa trên thế giới.

Bình minh của IVF

Từ những năm 1930, việc nghiên cứu hiện tượng thụ tinh giữa trứng và tinh trùng động vật bậc cao trong môi trường bên ngoài cơ thể (in-vitro) đã được chú ý.  Năm1959, Chang lần đầu tiên thành công trong việc cho thụ tinh giữa tinh trùng và trứng động vật có vú (thỏ) trong điều kiện phòng thí nghiệm. Đây được xem là thành tựu quan trọng nhất trong lịch sử phát triển của IVF. Nó chứng tỏ trứng và tinh trùng của động vật có thể thụ tinh được bên ngoài cơ thể. Từ sau thí nghiệm này IVF đã được nghiên cứu trên nhiều loài động vật khác nhau, kể cả người. Nhiều thành tựu về IVF trên động vật nghiên cứu đã được công bố sau đó.

R.G. Edwards, người Anh, là một trong những nhà khoa học tiên phong trong việc nghiên cứu về IVF trên người. Năm 1966, Edwards đến Mỹ và cùng với một nhóm nhà khoa học Mỹ,  đứng đầu là giáo sư Howard Jones, lần đầu tiên công bố trường hợp lấy được trứng người qua phẫu thuật nội soi tại Mỹ. Tuy nhiên, nhóm nghiên cứu này thất bại trong việc chứng minh trứng và tinh trùng người có thể thụ tinh được bên ngoài cơ thể. Mặc dù, nhóm nghiên cứu này đã cố gắng trình bày một số dấu hiệu chưa rõ ràng của hiện tượng thụ tinh giữa trứng và tinh trùng người bên ngoài cơ thể.

Trong thời gian này, nhiều nhóm nghiên cứu ở Anh, Mỹ, Úc đã tiến hành thực hiện IVF ở người. Đến năm 1971, Steptoe và Edwards ở Anh lần đầu tiên báo cáo nuôi cấy được phôi nang (blastocyst) người trong ống nghiệm và chuyển các phôi này vào buồng tử cung phụ nữ. Tuy nhiên, trong thời gian này, các phác đồ chuẩn bị nội mạc tử cung chưa được nghiên cứu kỹ và các nhà khoa học đã phạm phải nhiều sai lầm trong việc sử dụng nội tiết tố để chuẩn bị nội mạc tử cung. Do đó, mãi đến năm 1976, trường hợp có thai đầu tiên từ IVF trên thế giới mới được ghi nhận tại một bệnh viện nhỏ (Oldham) ở Anh do bác sĩ Steptoe và tiến sĩ Edwards công bố. Nhưng thật đáng tiếc, đây lại là một trường hợp thai ngoài tử cung.

Đến năm 1978, em bé đầu tiên từ IVF, Louis Brown, ra đời đánh dấu bước đầu cho sự phát triển của IVF trên người. Em bé Louis Brown được sinh ra từ một bà mẹ vô sinh do tổn thương hai ống dẫn trứng đã được điều trị bằng phẫu thuật nhưng không hiệu quả. Công trình được công bố tại Anh, tác giả là bác sĩ Steptoe và tiến sĩ Edwards. Trong thực tế, Edwards và Steptoe đã thất bại hàng trăm lần để có được thành công vang dội này. Sau một vài thành công ban đầu, chương trình IVF tại Oldham tạm gián đoạn cho đến năm 1980, bác sĩ Steptoe và tiến sĩ Edwards mới có thể tiếp tục lại chương trình IVF tại Bệnh viện Bourn Hall (Anh), chương trình này tiếp tục gặt hái thành công và bệnh viện Bourn Hall được xem là cái nôi của IVF trên thế giới.

Trong giai đoạn đầu này, các nhà khoa học tiên phong như Edwards và Steptoe đã bị chỉ trích và phản ứng kịch liệt không chỉ từ dư luận, tôn giáo mà còn từ một số lớn các nhà khoa học đương thời. Trong một thời gian dài nhiều năm, các nhà khoa học kiệt xuất này đã âm thầm làm việc, nghiên cứu và đã phải trãi qua bao nhiều gian truân, thất bại để đạt đến kết quả. Việc em bé đầu tiên ra đời từ IVF thật sự là một sự kiện chấn động trong dư luận và giới khoa học ở Anh cũng như thế giới.

IVF được đón nhận và phát triển trên tòan thế giới

Năm 1980, em bé IVF thứ tư trên thế giới được sinh ra tại Úc. Trung tâm Monash ở Úc được ghi nhận là nơi thứ hai trên thế giới thực hiện thành công IVF. Trung tâm này sau đó liên tục báo cáo các trường hợp sanh sau IVF. Do trung tâm IVF đầu tiên ở Anh tạm ngưng hoạt động sau 3 trường hợp sanh đầu tiên, người ta ghi nhận rằng 12 trong số 15 em bé IVF đầu tiên trên thế giới được ra đời từ trung tâm Monash ở Úc. Cho đến nay, trung tâm IVF tại Monash Uc vẫn giữ vai trò là một trung tâm đầu ngành về IVF trên thế giới.

Sau đó, trong những năm 80, kỹ thuật IVF đã được phát triển rất mạnh và lần lượt được báo cáo thành công tại nhiều nước ở nhiều khu vực trên thế giới, kể cả ở Châu Á. Năm 1981, em bé IVF đầu tiên ở Mỹ ra đời. Đây cũng là trường hợp IVF đầu tiên sử dụng gonadotropin để kích thích buồng trứng. Các nước ở Châu Au cũng đồng lọat triển khai IVF trong những năm đầu thập niên 80. Singapore được ghi nhận là nơi thực hiện thành công IVF đầu tiên ở Châu Á vào năm 1983 bởi nhóm nghiên cứu của S.C. Ng và cộng sự tại Bệnh viện Trường Đại học quốc gia Singapore. Sau đó, IVF cũng được thực hiện thành công tại Nhật, Trung quốcThái lan, Malaysia, Indonesia và Philippines suốt các năm trong thập niên 80.

Sự phát triển và hoàn thiện về kỹ thuật của IVF

Ở những chu kỳ IVF đầu tiên được thực hiện, người ta chỉ chọc hút trứng qua nội soi trên những buồng trứng phát triển tự nhiên, nên thường chỉ lấy được 1 trứng từ một phụ nữ. Do đó tỉ lệ thành công thường rất thấp. Khi IVF bắt đầu phát triển rộng rãi, việc sử dụng nội tiết tố để kích thích buồng trứng ngày càng phổ biến. Nhờ kỹ thuật kích thích buồng trứng, người ta có thể lấy được trung bình khỏang 10 trứng ở một người phụ nữ để thực hiện IVF. Điều này giúp tăng số phôi có được và người ta có thể chọn lựa những phôi có chất lượng tốt để chuyển vào buồng tử cung, làm gia tăng đáng kể tỉ lệ thành công của IVF.

Từ năm 1983, siêu âm đầu dò âm đạo được giới thiệu và kỹ thuật chọc hút trứng qua ngả âm đạo với với hướng dẫn của siêu âm đầu dò âm đạo được giới thiệu lần đầu tiên và thay thế hoàn toàn việc chọc hút trứng quan nội soi tốn kém, nguy hiểm và kém hiệu quả. Thành tựu này làm thay đổi đáng kể bộ mặt của kỹ thuật IVF. Kỹ thuật này biến IVF trở thành một kỹ thuật đơn giản, ít xâm lấn và có thể thực hiện ở những cơ sở điều trị nhỏ.

Cùng với việc phát triển mạnh mẽ của IVF, năm 1984, kỹ thuật chuyển giao tử vào vòi trứng (GIFT) được báo cáo thành công tại Mỹ do bác sĩ Asch khởi xướng. Trong kỹ thuật GIFT, trứng người và tinh trùng được lấy ra ngòai cơ thể, xử lý, sau đó, tinh trùng và trứng chỉ tiếp xúc nhau sau khi được bơm vào vòi trứng bằng nội soi ổ bụng. Kỹ thuật tương đối xâm lấn (invasive) do phải thực hiện qua nội soi ổ bụng và phải đòi hỏi phải có ít nhất 1 ống dẫn trứng bình thường. Dù vậy, GIFT đã ra đời và phát triển mạnh những năm sau đó, chủ yếu ở Mỹ, nhờ 2 lý do: (1) các phác đồ nuôi cấy phôi trong điều kiện nhân tạo chưa hoàn thiện, (2) một số quan điểm tôn giáo không chấp nhận IVF. Một kỹ thuật khác tương tự là chuyển hợp tử vào vòi trứng (ZIFT) cũng phát triển sau đó. Trong kỹ thuật này, hợp tử được hình thành trong môi trường bên ngoài cơ thể sẽ được bơm vào vòi trứng dưới hướng dẫn của nội soi ổ bụng. Đến cuối thập niên 90, GIFT và ZIFT ngày càng bị thu hẹp chỉ định do phác đồ nuôi cấy phôi được cải thiện đáng kể và IVF ngày càng trở nên phổ biến và được chấp nhận rộng rãi.

1984, em bé đầu tiên ra đời từ trường hợp một phụ nữ không còn buồng trứng, thực hiện xin trứng-IVF  tại Úc. Đây là lần đầu tiên, một phụ nữ có thể có con với trứng của một người phụ nữ khác. Cũng trong năm này, nhóm nghiên cứu của Alan Trounson ở Monash (Úc) cũng tiếp tục công bố trường em bé đầu tiên sinh ra từ phôi người đông lạnh. Từ đó, trên nền cơ bản của IVF, các kỹ thuật xin trứng-IVF và trữ lạnh phôi đã phát triển góp phần đáng kể vào việc tăng hiệu quả của kỹ thuật IVF. Trong một bước đột phá của IVF, năm 1997, trường hợp có thai ở phụ nữ 63 tuổi với kỹ thuật xin trứng-IVF được báo cáo. Điều này chứng tỏ chức năng mang thai của tử cung còn có thể duy trì được khá lâu sau khi mãn kinh, nếu được bổ sung đủ nội tiết. Tuy nhiên, đa số các nước đều qui định tuổi giới hạn của người xin trứng, thường dao động từ 45 đến 55 tuổi.

1986, Chen báo cáo trường hợp có thai từ trứng người sau đông lạnh và rã đông tại Úc. Tuy nhiên, trong một thời gian dài sau đó, các phác đồ trữ lạnh trứng cho hiệu quá kém và tỉ lệ thành công được báo cáo rất thấp. Do đó, trong hơn một thập niên sau đó, kỹ thuật trữ trứng vẫn còn được cho là không hiệu quả và thực hiện rất hạn chế ở một số rất ít trung tâm. Năm 2001, một bước tiến tiếp theo trong kỹ thuật trữ lạnh trứng người đã giúp hòan thiện thêm kỹ thuật này. Các bác sĩ ở Bologna, Ý đã công bố một phác đồ trữ lạnh trứng mới làm tăng đáng kể tỉ lệ sống và thụ tinh của trứng sau trữ lạnh. Từ phát kiến này, kỹ thuật trữ lạnh trứng bắt đầu được đánh giá là một kỹ thuật hiệu quả và việc áp dụng trữ lạnh trứng dần dần được càng nhiều trung tâm trên thế giới đưa vào áp dụng thường qui.

Sau một thời gian đầu, IVF được chỉ định chủ yếu cho vô sinh nữ. Dần dần, IVF được áp dụng cho các trường hợp thiểu năng tinh trùng. Tuy nhiên, các thử nghiệm áp dụng IVF cho vô sinh nam trong thời gian đầu này cho kết quả khá thất vọng với tỉ lệ thụ tinh giữa trứng và tinh trùng rất thấp và nhiều trường hợp hoàn toàn không có thụ tinh giữa trứng và tinh trùng. Để cải thiện tình trạng này, nhiều kỹ thuật vi thao tác (micromanipulation) đã được nghiên cứu để hỗ trợ cho việc thụ tinh giữa trứng và tinh trùng trong các trường hợp thiểu năng tinh trùng. Trong các kỹ thuật vi thao tác, người ta dùng các kim bằng thủy tinh cực nhỏ để thao tác trên trứng và tinh trùng dưới kính hiển vi.

Năm 1988, trường hợp tiêm tinh trùng vào dưới màng trong suốt (SUZI) được báo cáo thành công lần đầu tiên tại Singapore bởi S.C. Ng và cộng sự. Trong kỹ thuật này, tác giả đã tiêm trực tiếp một vài tinh trùng qua màng trong suốt (zona pellucida) vào khoang quanh noãn (perivitaline space) để hỗ trợ cho tinh trùng thụ tinh với trứng. Vào năm 1989, kỹ thuật đục thủng màng trong suốt (PZD) để hỗ trợ thụ tinh được giới thiệu ở Mỹ bời Cohen. Trong kỹ thuật này, Cohen đã sử dụng kỹ thuật vi thao tác để đục một lổ thủng trên màng trong suốt, sau đó cấy trứng với tinh trùng. Tuy nhiên, cả 2 kỹ thuật trên đều không đạt hiệu quả cao do tỉ lệ thụ tinh của trứng và tinh trùng vẫn không tăng đáng kể trong khi tỉ lệ thụ tinh đa tinh trùng (polyspermia), do nhiều hơn 1 tinh trùng đi vào trứng, lại gia tăng.

Cho đến 1992, kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương trứng (ICSI) được báo cáo thành công lần đầu tiên tại Bỉ bởi Palermo và cộng sự. Trong kỹ thuật này, các tác giả đã tiêm trực tiếp 1 tinh trùng vào trứng để hỗ trợ sự thụ tinh. Các thử nghiệm đầu tiên cho thấy sau khi tiêm tinh trùng tvào trứng, tế bào trứng vẫn có thể hồi phục, sự thụ tinh diễn ra và phôi sau đó phát triển khá tốt. Tỉ lệ có thai lâm sàng của kỹ thuật ICSI luôn nhỉnh hơn so với kỹ thuật IVF cổ điển, mặc dù chất lượng và số lượng tinh trùng kém. Sự thành công này đã thực sự là một cuộc cách mạng trong điều trị vô sinh nam. Nếu như trong sinh lý tự nhiên, người đàn ông cần sản xuất ra hàng chục triệu đến hàng trăm triệu tinh trùng trong một lần phóng tinh để có thể thụ tinh được một noãn trong vòi trứng, thì với kỹ thuật ICSI, sự thụ tinh có thể diễn ra giữa duy nhất 1 trứng và 1 tinh trùng. Cho đến nay, do vấn đề vô sinh nam ngày càng phổ biến đi kèm với hiệu quả của kỹ thuật ICSI được cải thiện không ngừng, ICSI đã dần dần trở thành kỹ thuật được thực hiện nhiều nhất tại các trung tâm hỗ trợ sinh sản. Hiện nay, đặc biệt tại một số trung tâm lớn, ICSI còn được áp dụng thay thế hoàn toàn kỹ thuật IVF cổ điển ngay cả đối với các trường hợp không liên quan đến vô sinh nam.

Năm 1994, trường hợp có thai đầu tiên từ trứng non trưởng thành trong ống nghiệm (IVM) được báo cáo tại Úc. Trong kỹ thuật này, trứng non được chọc hút từ những nang nhỏ của buồng trứng vào giai đọan sớm của pha nang noãn. Những trứng này sau đó được nuôi cấy với môi trường đặc biệt có sử dụng nội tiết tố FSH. Một tỉ lệ lớn trứng có thể trưởng thành và được hỗ trợ thụ tinh bằng phương pháp ICSI. Kỹ thuật trên đã tạo ra một hướng mới trong IVF, trong đó không cần sử dụng nhiều nội tiết tố để kích thích buồng trứng. Do đó, IVM góp phần làm giảm chi phí điều trị và các biến chứng có thể có torng khi kích thích buồng trứng trong IVF. Kỹ thuật này đặc biệt thích hợp với các bệnh nhân có hội chứng buồng trứng đa nang.

Trước khi kỹ thuật ICSI ra đời và ổn định, những trường hợp nam giới không có tinh trùng do bế tắc (obstructive azoospermia) thường được điều trị bằng cách hút tinh trùng ở trước vị trí tắc để bơm tinh trùng vào buồng tử cung (IUI) hoặc thực hiện IVF. Một số báo cáo thực hiện IUI hoặc IVF với tinh trùng hút từ mào tinh đã được báo cáo vào thập niên 80. Các báo cáo này cho thấy tỉ lệ thành công là rất thấp. Kỹ thuật ICSI ra đời đã tạo ra một bước ngoặt lớn trong vấn đề điều trị không có tinh trùng do bế tắc. Năm 1994, các trường hợp MESA-ICSI (hút tinh trùng từ mào tinh qua vi phẫu và tiêm tinh trùng vào bào tương trứng) đầu tiên được báo cáo. Nhiều báo cáo cho thấy tỉ lệ có thai của kỹ thuật này thậm chí cao hơn cả kỹ thuật ICSI và IVF thông thường mặc dù tinh trùng chưa trưởng thành trọn vẹn. Năm 1995, kỹ thuật PESA-ICSI (chọc hút tinh trùng từ mào tinh xuyên da và tiêm tinh trùng vào bào tương trứng) được giới thiệu đã giúp đơn giản hóa việc điều trị không có tinh trùng do bế tắc. Trong kỹ thuật PESA, không cần phải mở bao tinh hoàn mà chỉ cần chọc kim sinh thiết vào mào tinh và hút tinh trùng. Kỹ thuật PESA khá đơn giản và có thể thực hiện ở những phòng khám tư. Dù số lượng tinh trùng lấy được từ kỹ thuật này không nhiều nhưng vẫn đảm bảo để thực hiện kỹ thuật ICSI.

Với những thành công trên với các trường hợp không tinh trùng do bế tắc. 1995, kỹ thuật TESE-ICSI (phân lập tinh trùng từ tinh hoàn ở những trường hợp giảm sinh tinh tại tinh hoàn và tiêm tinh trùng vào bào tương trứng) được báo cáo thành công. Ở các trường hợp này, tinh hoàn giảm sản xuất tinh trùng nghiêm trọng, đến mức không thể tìm thấy tinh trùng trong tinh dịch. Kích thước tinh hoàn thường nhỏ hoặc chỉ còn 1 bên tinh hoàn hoạt động, chức năng sản xuất nội tiết tố nam của tinh hoàn cũng giảm. Trong hầu hết các trường hợp, các tổn thương này là không hồi phục và không điều trị được. Tỉ lệ thành công của TESE-ICSI cũng đạt gần tương đương với tỉ lệ thành công chung của IVF. Với sự thành công của kỹ thuật này, vấn đề vô sinh nam gần như đã được giải quyết triệt để. Có thể nói, để điều trị vô sinh nam hiện nay, chỉ cần trả lới câu hỏi “Có thể tìm được vài tinh trùng hay không?”.

Sự phát triển của trẻ sinh ra từ kỹ thuật IVF

Đây là vấn đề quan tâm hàng đầu của các nhà khoa học, ngay từ khi IVF mới ra đời. Đây thậm chí đã là một vấn đề được đưa ra để chống đối việc thực hiện IVF. Thực tế cho thấy sự phát triển của hợp tử và phôi người bên ngoài cơ thể trong những ngày đầu tiên không ảnh hưởng đến sử phát triển và biệt hóa của phôi sau này.

Rất nhiều nghiên cứu đã được thực hiện bởi nhiều trung tâm, nhiều tổ chức khoa học trong hơn 25 năm qua để theo dõi sự phát triển về thể chất, tâm lý và khả năng sinh sản của các trẻ sinh ra từ IVF. Hầu hết các nghiên cứu đều kết luận không có sự khác biệt về sự phát triển về thể chất và tâm thần của các trẻ sinh ra từ IVF so với trẻ bình thường, ngoại trừ một số vấn đề như trẻ đa thai và nhẹ cân có tỉ lệ cao hơn trong IVF.

Một vấn đề khác hiện đang được quan tâm là các nhà khoa học tìm ra mối liên quan giữa một số bất thường về di truyền có liên quan đến một số các trường hợp vô sinh nam nặng. Các bất thường này có thể truyền cho thế hệ sau thông qua kỹ thuật IVF/ICSI. Tuy nhiên, trong đa số các trường hợp, các bất thường này chủ yếu liên quan đến khả năng sinh sản mà ít ảnh hưởng đến các chức năng họat động khác của cơ thể.

Các ứng dụng khác của IVF

Khỏang trong vòng 10 năm trở lại, kỹ thuật IVF còn được sử dụng như một công cụ trong chẩn đóan tiền sản và chọn lọc trước khi mang thai. Hiện nay, để loại trừ các trường hợp có nguy cơ mắc bệnh di truyền ở thai nhi, người ta chủ động chẩn đoán di truyền ngay trên các phôi trước khi chuyển vào buồng tử cung. Trong các trường hợp này, IVF có thể được thực hiện trên các cặp vợ chồng có các các bệnh lý di truyền có thể truyền cho con, trong khi hoàn toàn không có vấn đề hiếm muộn con. Kỹ thuật này được gọi là PGD (Pre-implantation Genetic Diagnosis), tạm dịch là chẩn đoán di truyền trước khi phôi làm tổ. Trong kỹ thuật PGD, người ta thực hiện sinh thiết một hoặc vài phôi bào để chẩn đoán di truyền của phôi khảo sát. Sau đó, phôi đó sẽ được quyết định hủy hoặc chuyển vào buồng tử cung tùy theo kết quả các xét nghiệm di truyền. Hiện nay đã có hàng nghìn em bé đã ra đời trên thế giới từ những phôi đã được tầm soát về di truyền. Có nhiều lo ngại là với kỹ thuật này có thể bị lạm dụng để chọn lựa phôi, mang thai và sinh ra em bé với những kiểu di truyền được “đặt hàng” trước.

Một ứng dụng khác đang thu hút sự quan tâm của giới khoa học và y học là nuôi cấy và biệt hóa tế bào gốc từ phôi người (human embryonic stem cell). Phôi dư từ các chu kỳ IVF hiện nay đang được nghiên cứu để nuôi cấy thành tế bào gốc để biệt hóa thành nhiều lọai mô trong cơ thể để tiến tới thực hiện “ghép mô” cho các đối tượng có nhu cầu. Nếu có thể thành công thì nguồn mô ghép được sản xuất từ các tế bào gốc từ phôi này là vô tận. Các lãnh vực nghiên cứu nhiều tiềm năng trong tương lai là mô cơ tim, mô thần kinh, mô gan, mô tụy…

IVF còn là kỹ thuật cơ bản để thực hiện nhân bản (cloning). Nguyên tắc cơ bản của cloning là tạo phôi từ sự kết hợp giữa bộ nhiễm sắc thể của 1 tế bào sinh dưỡng và tế bào chất của trứng để tạo thành phôi. Phôi này sau đó có thể phát triển để tạo thành các thể hòan chỉnh. Cá thể mới hình thành sẽ có kiểu di truyền hoàn toàn tương tự với tế bào sinh dưỡng sử dụng. Nếu sử dụng tế bào sinh dưỡng từ một người bệnh, người ta có thể nuôi cấy các tế bào gốc từ phôi và biệt hóa thành nhiều loại mô để xây dựng  một ngân hàng mô dự trữ cho chính người bệnh này.

Cho đến nay, sự thành công và phát triển không ngừng của IVF đã giúp con người có thể can thiệp khá sâu vào qui trình sinh sản của người cũng như các ứng dụng vào các lãnh vực khác trong y học. Việc ứng dụng thành công IVF trên người là một thành tựu y học và sinh học lớn của nhân loại. IVF đã từng được chọn là 1 trong 10 thành tựu khoa học vĩ đại nhất của nhân loại trong thế kỷ 20.

Tài liệu tham khảo

1. http://www.repromed.org.uk/history/20th_world.htm
2. Edwards R.G: Tribute to Georgeanna and Howard Jones. Reproductive Biomedicine Online, vol 6(3), pp. 352-360.
3. Jones H.: IVF: Past and future. Reproductive Biomedicine Online, vol 6(3), pp. 375-381.