ThS. Nguyễn Thị Thu Lan, Khoa Hiếm muộn - Bệnh viện Từ Dũ

GIỚI THIỆU
Trứng và phôi có thể sống, tiếp tục phát triển sau khi được đông lạnh - rã đông hay không; chúng ta có thể khống chế được những rủi ro xảy ra cho trứng và phôi trong suốt quá trình thực hiện hay không là điều không dễ dàng. Ngoài việc thành thạo về thao tác của người thực hiện, chọn lựa được chất lượng trứng và phôi tốt để lưu trữ, việc chọn lựa một chương trình hạ nhiệt độ thích hợp có ảnh hưởng rất lớn đến thành công của một quy trình đông lạnh trứng và phôi. Hiện nay, kỹ thuật đông lạnh có thể được chia thành 2 nhóm chính: hạ nhiệt độ chậm (slow freezing) và thủy tinh hóa (vitrification). Sự lựa chọn phác đồ đông lạnh ở từng trung tâm phụ thuộc vào một số yêu cầu như (1) tính hiệu quả, (2) tính an toàn, (3) tính tiện lợi và (4) khả năng ứng dụng trong thực tế để phù hợp với điều kiện hiện có của từng trung tâm.
Trong thời điểm hiện tại, ở nhiều trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm, phương pháp hạ nhiệt độ chậm với chất bảo vệ đông lạnh (cryoprotectant) là Propanediol (PrOH) đang được ứng dụng khá phổ biến. Với phác đồ đông lạnh và rã đông hiện đang được sử dụng như trên, nhiều báo cáo trên thế giới cho thấy tỷ lệ phôi sống sau rã đông vào khoảng 70 – 80% và tỷ lệ thai lâm sàng trên một chu kỳ chuyển phôi trữ lạnh thay đổi tùy trung tâm, chỉ trong khoảng 16 – 30%. Phương pháp hạ nhiệt độ chậm có thể dẫn đến hình thành tinh thể nước đá bên trong tế bào khi nhiệt độ hạ từ -50oC đến -150oC. Đây là nguyên nhân chính gây vỡ màng trong suốt hoặc vỡ tế bào và dẫn đến thất bại.

Trong vài năm gần đây, phương pháp thủy tinh hóa với các cải tiến mới được nhiều trung tâm áp dụng thành công trong trữ lạnh trứng và phôi người. Phương pháp thủy tinh hóa rất được các nhà phôi học lâm sàng quan tâm và áp dụng ngày càng phổ biến (chủ yếu trên trứng và phôi phát triển ngày 3 hoặc ở giai đoạn phôi nang) nhờ tính chất đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả cao. Thành công của việc ứng dụng này góp phần không nhỏ trong việc tiết kiệm được thời gian và nhân sự trong một đơn vị thụ tinh trong ống nghiệm ở người, đồng thời giảm chi phí điều trị và nâng cao tỉ lệ thành công cho người bệnh.

KỸ THUẬT THỦY TINH HÓA (Vitrification)

Trữ lạnh phôi và trứng người được thực hiện thành công đầu tiên bởi Trouson vào năm 1986. Sau sự ra đời của em bé đầu tiên từ phôi trữ lạnh (năm 1983), trữ lạnh phôi trở thành một hướng mở không thể thiếu trong lĩnh vực hỗ trợ sinh sản ở người.

Phương pháp đông lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa được Rall và Fahy thực hiện thành công đầu tiên trên phôi bò vào năm 1985. Kỹ thuật này được thực hiện rộng rãi trên gia súc vào nhiều năm sau đó. Tuy nhiên, quy trình này chỉ được Kuleshova và Lopata ứng dụng đầu tiên trên trứng người vào năm 1999 và sau đó vài tháng, được thực hiện đầu tiên trên phôi người đang phát triển ở giai đoạn phôi nang bởi Lane. Vào ngày 20/6/1999, em bé đầu tiên trên thế giới từ phôi trữ lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa ra đời.
Hiện nay, đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa đang là một kỹ thuật được các trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm lớn trong khu vực và thế giới đưa vào ứng dụng trong thực tiễn điều trị và đang dần thay thế phương pháp hạ nhiệt độ chậm trước đây. Bên cạnh đó, các nhà khoa học cũng không ngừng thực hiện những kiểm chứng lâm sàng nhằm chứng minh kỹ thuật này thật sự an toàn đối với con người.

Khái niệm về phương pháp thủy tinh hóa

Thủy tinh hóa là quá trình làm lạnh mẫu trứng hoặc phôi với thời gian rất nhanh. Trong suốt quá trình hạ nhiệt độ, toàn bộ khối vật chất bên trong và bên ngoài tế bào chuyển thành dạng khối đặc, trong suốt giống như thủy tinh (glass-like), đặc biệt không có sự hình thành tinh thể đá bên trong mẫu tế bào, cũng như môi trường bên ngoài trong quá trình làm lạnh.
Sau khi được cân bằng với môi trường có nồng độ chất bảo quản đông lạnh rất cao (4 – 8M), mẫu trứng hoặc phôi được cho vào các dụng cụ chứa và nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng, không qua quá trình hạ nhiệt độ theo từng bước như trong đông lạnh chậm. Tốc độ làm lạnh của phương pháp này rất lớn, khoảng 2000 – 2500oC / phút.

Ưu điểm của kỹ thuật thủy tinh hóa

Trong hạ nhiệt độ chậm, quá trình mất nước cần được diễn ra từ từ để hạn chế sự thành lập tinh thể nước đá. Do đó, thời gian cần thiết để hoàn tất một quy trình đông lạnh bằng phương pháp hạ nhiệt độ chậm có thể kéo dài gấp 10 lần so với hạ nhiệt độ cực nhanh. Để có thể đảm bảo được tốc độ hạ nhiệt trong phương pháp đông lạnh chậm, người ta cần trang bị hệ thống hạ nhiệt độ bằng hơi nitơ lỏng. Chi phí đầu tư cho một hệ thống này rất cao, chưa kể đến chi phí bảo trì và sửa chữa hằng năm. Trong khi đó, với phương pháp thủy tinh hóa, cơ sở thực hiện không cần phải trang bị bất kỳ thiết bị nào.

Nồng độ chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng trong phương pháp thủy tinh hóa cao gấp 4 – 5 lần so với nồng độ chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng trong phương pháp đông lạnh chậm trước đây. Ưu thế này giúp cho quá trình khử nước bên trong tế bào xảy ra nhanh và hoàn toàn hơn. Kết quả là không có sự hình thành thể đá bên trong tế bào, nhờ đó tế bào có thể tránh được những tổn thương màng và các bào quan do tinh thể đá gây ra. Qua kết quả đánh giá thực nghiệm, phương pháp thủy tinh hóa cho tỉ lệ sống sau rã đông của phôi và trứng cao hơn rất nhiều so với phương pháp đông lạnh chậm trước đây.

Hiệu quả cao của đông lạnh bằng phương pháp hạ nhiệt độ cực nhanh so với hạ nhiệt độ chậm cũng được nhiều tác giả báo cáo. Các nghiên cứu thực nghiệm trên phôi chuột cũng như phôi người ở các giai đoạn phát triển đều cho thấy tỷ lệ phôi bào còn sống sau rã đông, tỷ lệ phôi tiếp tục phát triển sau rã đông cũng như số tế bào trong khối tế bào bên trong (ICM – inner cell mass) của phôi nang ở nhóm phôi đông lạnh bằng hạ nhiệt độ cực nhanh cao hơn so với nhóm phôi sử dụng phương pháp hạ nhiệt độ chậm. Tuy chưa có một nghiên cứu nào đủ lớn được thực hiện nhằm đánh giá hiệu quả của phương pháp này ở tất cả các giai đoạn phát triển của phôi, nhưng kết quả bước đầu rất khả quan, đặc biệt ở những trường hợp trữ lạnh trứng. Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ phôi phân chia và tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang từ những chu kỳ sử dụng trứng trữ lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa cao hơn so với nhóm trữ lạnh bằng phương pháp hạ nhiệt độ chậm… Do đó, tại hầu hết các báo cáo về đông lạnh trứng người, phương pháp thủy tinh hóa là kỹ thuật được ưu tiên lựa chọn đầu tiên.

Tính an toàn của phương pháp này cũng được chứng minh qua một số nghiên cứu. trong một nghiên cứu vào năm 2005 tại Nhật trên 147 trẻ sinh ra từ phôi trữ lạnh bằng phương pháp hạ nhiệt độ cực nhanh, các tác giả đã không tìm thấy sự khác biệt nào về các yếu tố sản khoa cũng như tỷ lệ dị tật so với nhóm trẻ sinh ra từ chuyển phôi tươi.

Qua bảng so sánh (bảng 1), chúng ta có thể nhận thấy rằng phương pháp thủy tinh hóa tỏ ra có nhiều ưu thế hơn so với phương pháp đông lạnh chậm: ngoài ưu điểm tiết kiệm về thời gian, giảm bớt chi phí cho một trường hợp đông lạnh trứng hoặc phôi, khả năng sống sau rã đông của trứng / phôi khi được đông lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa cao hơn rất nhiều so với kỹ thuật đông lạnh chậm.

Bảng 1: So sánh giữa hai phác đồ đông lạnh

Chất bảo vệ đông lạnh (cryoprotectant)

Nhìn chung, các chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng trong kỹ thuật thủy tinh hóa gần giống như trong kỹ thuật đông lạnh chậm trước đây, nhưng nồng độ sử dụng cao hơn. Trong một dung dịch dùng để thủy tinh hóa luôn bao gồm 1 hoặc 2 chất bảo vệ đông lạnh có khả năng thấm qua màng tế bào (permeable cryoprotectant) để khử nước bên trong tế bào và 1 chất bảo vệ đông lạnh không có khả năng thấm qua màng tế bào (non-permeable cryoprotectant) làm đối trọng, giúp quá trình khử nước bên trong tế bào xảy ra nhanh hơn.

- Chất bảo vệ đông lạnh có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào: ethylene glycol (được sử dụng phổ biến nhất), propylene glycol, acetamid, glycerol, raffinose, dimethylsulphoxide (DMSO) và 1,2-propanediol (PrOH).
- Chất bảo vệ đông lạnh không có khả năng thấm qua màng tế bào: sucrose, trehalose, glucose và galactose.

Trong thành phần môi trường thủy tinh hóa hiện nay, người ta thường sử dụng ethylene glycol và 1 chất bảo vệ đông lạnh khác cũng có khả năng thấm qua màng tế bào (thường là DMSO hoặc PrOH) kết hợp với sucrose. Sự kết hợp này vừa bảo đảm được khả năng thẩm thấu qua màng tế bào cao hơn so với khi chỉ sử dụng từng chất riêng lẻ, vừa giảm được độc tính của từng thành phần riêng lẻ tác động lên tế bào khi sử dụng chúng ở nồng độ cao.

Dụng cụ