CNSH. Võ Minh Tuấn – IVFMD Tân Bình

Việc thao tác và biến đổi DNA bộ gen từ lâu đã là niềm khao khát của con người. Giấc mơ đó đã gần với hiện thực hơn bao giờ hết khi dự án giải mã bộ gen người hoàn thành năm 2003. Các kỹ thuật thao tác trên gen có ý nghĩa và tầm quan trọng to lớn trong việc giúp con người nghiên cứu chức năng của từng gen hoặc hệ gen, sửa chữa các sai hỏng do đột biến ở các bệnh di truyền, và biến đổi đặc điểm di truyền theo mục đích riêng của con người. Tuy nhiên, làm thế nào để biến đổi, sữa chửa sai hỏng đối với từng gen cụ thể là một thách thức rất lớn đối với các nhà khoa học.

Hệ thống CRISPR/Cas
Trình tự CRISPR lần đầu tiên được tìm ra vào năm 1987 do các nghiên cứu của Yoshizumi Ishino và cộng sự. Điều này thúc đẩy các nhà khoa học tập trung nghiên cứu chức năng đặc biệt của chúng trong hệ miễn dịch của vi khuẩn trong những năm gần đây. Vào năm 2012, hai nhóm nghiên cứu độc lập ở Mỹ đã cùng khám phá ra cơ chế hoạt động của enzyme Cas và CRISPR (Doudna và cộng sự, 2014). Kể từ khi được phát hiện, hệ thống CRISPR/Cas dần được nghiên cứu và ứng dụng vào mục đích chỉnh sửa gen, cụ thể là bổ sung, xóa và thay đổi chính xác vật liệu di truyền của sinh vật (Chaoro và cộng sự, 2017). Nó đã trở thành công cụ quan trọng trong nghiên cứu y sinh và các lĩnh vực sinh học khác nhau, trong đó phải kể đến các trườn hợp vô sinh do nam giới. Nguyên nhân cơ bản của vô sinh nam thường do nhiều yếu tố và trường hợp vô tinh không do bế tắc (non-obstructive azoospermia – NOA) được cho là hậu quả của bất thường di truyền. Hiện nay một số nguyên nhân di truyền của NOA đã được xác định nhưng chắc chắn còn rất nhiều nguyên nhân di truyền chưa được chúng ta phát hiện. Vì vậy, CRISPR/Cas9 được xem là một công cụ đầy hứa hẹn để cung cấp thêm thông tin về di truyền cũng như ứng dụng vào điều trị vô sinh.

Cơ chế hoạt động của hệ thống CRISPR/Cas9
Hệ thống này hoạt động dựa trên cơ chế miễn dịch tự nhiên của các loài vi khuẩn cổ chống lại sự xâm nhập của DNA ngoại loai từ virus. Khác với hệ thống miễn dịch dựa trên enzyme cắt giới hạn (Restriction enzyme – RE), hệ thống này dựa trên phân tử RNA để nhận diện và loại bỏ DNA ngoại lai. Các loài vi khuẩn cổ sẽ gắn chèn một đoạn DNA mục tiêu tại vùng trình tự ngắn lặp lại có tên là CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat), CRISPR chứa đoạn DNA ngoại lai sẽ phiên mã và được xử lý thành các đoạn RNA ngắn (CRISPR-derived RNA – crRNA). Các crRNA này sẽ liên kết với enzyme Cas để nhận diện DNA mục tiêu thông qua liên kết bổ sung của trình tự crRNA và DNA mục tiêu, sau đó cắt phân tử DNA mục tiêu bằng hoạt động endonuclease của enzyme Cas (Doudna và cộng sự, 2014).

Các nhà nghiên cứu dựa trên cơ chế hoạt động của CRISPR/Cas để thiết kế hệ thống chỉnh sửa DNA trên động vật. Hệ thống bao gồm enzyme Cas9 có hoạt tính endonuclease và phân tử RNA dẫn đường (guide RNA – gRNA) (Ran và cộng sự, 2013). Trong đó, enzyme Cas9 có vai trò phân cắt DNA mục tiêu, còn gRNA có vai trò nhận diện DNA mục tiêu chứa trình tự bổ sung với phân tử gRNA. Ngoài ra, trên gRNA còn có sự hiện diện của trình tự PAM (Protospacer-Adjacent Motif) có vai trò quan trọng đối với quá trình nhận diện và gắn chuyên biệt của enzyme Cas9 vào trình tự DNA mục tiêu. Đối với enzyme Cas9, trình tự PAM gồm 3 nucleotide NGG, trong đó N là một nucleotide bất kỳ. Bằng việc thiết kế các trình tự gRNA khác nhau (20 nucleotide) dựa trên trình tự DNA mục tiêu, chúng ta hầu như có thể tác động đến bất kỳ gen nào.

Ứng dụng CRISPR/Cas9 trong điều trị vô sinh do nam giới
Hiện nay, ước tính có khoảng 40 – 50% các trường hợp vô sinh là do nam giới, trong đó Azoospermia được ước tính chiếm khoảng 20% trường hợp. Azoospermia được phân loại là vô tinh không do tắt (non-obstructive azoospermia – NOA) và vô tinh do bế tắt (obstructive azoospermia – OA). Vô tinh do tắt thường gặp nhất là do nhiễm trùng, chấn thương hoặc dị tật bẩm sinh ống sinh tinh, trong trường hợp này tinh hoàn vẫn có khả năng sản xuất tinh trùng (Baker và cộng sự, 2013).

Trường hợp vô sinh không do bế tắt (NOA) là một dạng vô sinh do nam giới nghiêm trọng. Đối với các trường hợp Vô tinh không do tắc (Nonobstructive azoospermia - NOA) thì kĩ thuật thu nhận tinh trùng từ tinh hoàn (Testicular sperm extraction – TESE) hoặc micro TESE kết hợp kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI) là phương pháp điều trị phù hợp. Tuy nhiên, tỉ lệ có trẻ sinh sống từ các cặp vợ chồng NOA sử dụng phương pháp này chỉ 21,4% (Esteves và cộng sự, 2013). Hiện nay, đa số những trường hợp NOA được xác định do các bất thường về di truyền gây ra, bao gồm các bất thường về nhiễm sắc thể Y, hội chứng Klinefelter, khiếm khuyết gen KAL1 hoặc FGFR1 trong hội chứng Kallmann (Chiba và cộng sự, 2016). Với những hiểu biết hiện tại về các bất thường di truyền liên quan đến NOA, việc áp dụng các kỹ thuật chỉnh sửa gen như CRISPR/Cas9 có tiềm năng lớn trong việc điều trị vô sinh do nam giới.

Hiện nay khi những hiểu biết của chúng ta về bất thường di truyền liên quan đến NOA phát triển, việc sửa chữa những bất thường này và khôi phục quá trình sinh tinh bằng hệ thống CRISPR/Cas9 là phương pháp đầy tiềm năng. Kỹ thuật này có thể được áp dụng cho các tế bào sinh dưỡng hoặc tế bào gốc sinh tinh được nuôi cấy in vitro, sau đó cấy vào tinh hoàn của bệnh nhân hoặc biệt hóa thành tế bào mầm in vitro. Ngoài ra, kỹ thuật này còn có thể được áp dụng cho cả tế bào tinh hoàn sơ cấp và tế bào gốc đa năng. Những ứng dụng này có nhiều hứa hẹn trong cuộc cách mạng hóa về điều trị vô sinh do nam giới, tuy nhiên cần xem xét vấn đề về mặc đạo đức.

Chỉnh sửa tế bào gốc tinh trùng bằng CRISPR/Cas9
Việc nuôi cấy tế bào gốc tinh trùng (Spermatogonial stem cell) đã được đề xuất như một phương pháp điều trị đầy hứa hẹn để phục hồi khả năng sinh sản ở nam giới NOA và nó đã được thực hiện thành cộng ở một số nghiên cứu trên mô hình động vật. Nghiên cứu đầu tiên được thực hiện vào năm 1994 trên chuột, họ tiến hành vi tiêm tế bào gốc tinh trùng vào ống sinh tinh của chuột đột biến gen liên quan đến quá trình sinh tinh và kết quả là quá trình sinh tinh của nhóm chuột này khôi phục và diễn ra bình thường (Brinster và cộng sự, 1994). Sau thành công này, các nghiên cứu sau đó được thực hiện trên nhiều loài động vật khác nhau. Kỹ thuật này không chỉ được chứng minh là khôi phục quá trình sinh tinh ở loài động vật gặm nhấm và còn thành công trên các mô hình động vật có vú và linh trưởng (Hermann và cộng sự, 2012).

Việc sử dụng hệ thống CRISPR/Cas9 để chỉnh sửa gen trong tế bào gốc tinh trùng (SSCs) lần đầu được báo cáo vào năm 2015. Những nỗ lực ban đầu của nhóm nghiên cứu nhằm chứng minh chỉnh sửa gen qua trung gian CRISPR/Cas9 trong SSCs không chỉ khả thi về mặt kỹ thuật mà còn có thể mang lại kết quả khả quan về tỉ lệ sinh sống. Những khám phá này cho thấy tiềm năng trong tương lai của việc áp dụng các kỹ thuật này để giải quyết các nguyên nhân di truyền gây vô sinh ở nam giới.

Trong số những bệnh nhân NOA, một số người mắc hội chứng chỉ có tế bào Sertoli (Sertoli cell-only syndrome – SCO), một số khác mắc trường hợp ngừng sinh tinh nửa chừng, do đó SSCs không thể biệt hóa thành tinh trùng. Thất bại trong quá trình biệt hóa thành tinh trùng xảy ra ở các giai đoạn khác nhau của quá trình sinh tinh. Dù vậy, SSCs vẫn có thể được phân lập từ một bệnh nhân có cả hai phân nhóm NOA kể trên và nuôi cấy in vitro (Lim và cộng sự, 2010). Ở nhóm NOA, việc phân lập SSCs và sử dụng hệ thống CRISPR/Cas9 đều có thể rút ngắn thời gian trong việc xác định và sửa chữa các bất thường di truyền dẫn đến hội chứng SCO hoặc ngừng sinh tinh nửa chừng của nhóm bệnh nhân NOA. Do đó ứng dụng này có khả năng khôi phục một phần quá trình sinh tinh, sau đó kết hợp với kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI). Tuy nhiên, cách tiếp cận này hiện vẫn là chủ đề của các cuộc tranh luận về đạo đức y học.

Ứng dụng thành công chỉnh sửa gene trên phôi thai người
Lần đầu tiên, các nhà khoa học đã tiến hành sửa chữa một đột biến gây bệnh bằng kỹ thuật chỉnh sửa gene trong giai đoạn đầu của phôi người. Kỹ thuật này sử dụng hệ thống CRISPR-Cas9 để điều chỉnh một đột biến gây bệnh liên quan đến tim, được thực hiện trong giai đoạn sớm của phôi thai, vì vậy khiếm khuyết này không được truyền cho các thế hệ sau. Việc biến đổi gene trên phôi người không chỉ tạo ra nhiều ảnh hưởng to lớn và thay đổi vĩnh viễn bộ gene của loài người, mà còn nhiều vấn đề đạo đức khác. Thêm vào đó, dù được cho là công nghệ chỉnh sửa bộ gene chính xác và hiệu quả nhất, nhưng nhiều vấn đề về kỹ thuật đặc biệt là chỉnh sửa lệch mục tiêu (off-target) vẫn còn đang được nghiên cứu và tối ưu hoá.

Trong khi vấn đề này còn đang được tranh luận khá nhiều và áp dụng một cách dè dặt ở phương Tây thì các nhà khoa học Trung Quốc đã thử nghiệm trên phôi người. Đầu tiên là công bố vào tháng 5 năm 2015, do một nhóm nghiên cứu ở Đại học Sun Yat-Sen, tại Quảng Châu, Trung Quốc thực hiện nhằm chỉnh sửa sai hỏng gây ra bệnh beta thalassemia ngay trên phôi người. Công bố này bị cả tạp chí Nature và Science từ chối đăng vì các vấn đề đạo đức. Họ còn có một số thử nghiệm khác nhưng không thành công, như thử nghiệm làm thay đổi gene để tạo khả năng miễn nhiễm với virus HIV. Năm 2017 một nhóm nghiên cứu ở Oregon Health & Science University, Mỹ, cũng đã thử nghiệm CRISPR-Cas9 trên phôi người 1 ngày tuổi để chỉnh sửa gene MYBPC3 gây bệnh cơ tim phì đại (hypertrophic cardiomyopathy) và thu được một số kết quả khả quan..
Cuộc tranh cãi chưa có hồi kết về kỹ thuật và đạo đức

Được xem là khám phá lớn nhất thế kỷ về công nghệ sinh học, các nhà khoa học ở các quốc gia đã áp dụng kỹ thuật biến đổi gene này vào nhiều mục đích, trong đó có việc tạo ra những siêu nhân và những đứa trẻ siêu việt. Các nhà khoa học đã chỉnh sửa ADN trực tiếp ngay trên phôi người được sản sinh từ thụ tinh trong ống nghiệm. Mục đích để tạo ra phôi có khả năng sống được nhưng xóa được hẳn lỗi di truyền từ thế hệ cha mẹ. Tuy nhiên, song song với những lợi ích vô cùng to lớn mà kỹ thuật biến đổi gene CRISPR-Cas9 mang lại, các cuộc tranh luận cũng không ngừng nổ ra.

Tại Hội nghị thượng đỉnh quốc tế diễn ra vào tháng 12/2015 ở Washington (Mỹ) do các cơ quan khoa học quốc gia Anh, Mỹ, Trung Quốc tổ chức, Ủy ban hội nghị cũng thừa nhận các vấn đề về an toàn chưa được xem xét kỹ, nhiều nước đang bắt đầu có các pháp lệnh và quy định cấm chỉnh sửa gene, đồng thời cũng đặt ra câu hỏi liệu có nên hợp thức hóa kỹ thuật này trong các hội nghị về sau.

Đầu năm 2016, Quốc hội Anh đã bỏ phiếu cho phép phương pháp gọi là “chuyển giao ty thể ở phôi thai người” - một liệu pháp thực nghiệm nhằm ngăn ngừa các bệnh di truyền hiếm gặp từ mẹ sang con. Nhưng bên cạnh đó, luật cấm bất kỳ hình thức nào khác của biến đổi gene phôi thai trừ khi dùng cho mục đích nghiên cứu và phôi hiến tặng trong trường hợp này phải tiêu hủy sau 14 ngày. Tuy nhiên, tại Mỹ, công nghệ này là bất hợp pháp.

KẾT LUẬN
Việc ứng dụng CRISPR/Cas9 để điều trị vô sinh hứa hẹn sẽ tạo ra những bước đột phá trong lĩnh vực này. Hiện nay một số nhóm nghiên cứu đã báo cáo những thành công liên quan với công nghệ này. Tuy nhiên, với việc áp dụng kỹ thuật này trên người, cần phải cân nhắc cẩn thận về mặt đạo đức và phát triển các quy định đồng thuận hơn nữa để đảm bảo tiến hành an toàn các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng cần thiết trên bệnh nhân.

Tài liệu tham khảo: Cinà, D.P., Phillips, D. & Flannigan, R. CRISPR/Cas9 in Male Factor Infertility. Curr. Tissue Microenviron. Rep. 1, 89–97 (2020). https://doi.org/10.1007/s43152-020-00011-y.

Từ khóa: Hệ thống CRISPR/CAS9 và tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực vô sinh nam