CNSH. Huỳnh Yến Vy – IVFMD Phú Nhuận – Bệnh viện Mỹ Đức Phú Nhuận

Hiện nay, kỹ thuật đông lạnh noãn được xem là một lựa chọn quan trọng trong quy trình hỗ trợ sinh sản bằng thụ tinh trong ống nghiệm (IVF), đặc biệt phù hợp với các phụ nữ có nhu cầu bảo tồn khả năng sinh sản do mong muốn trì hoãn sinh con hoặc đang chuẩn bị thực hiện các liệu pháp điều trị ung thư có nguy cơ gây độc cho tuyến sinh dục. Ngoài ra, đông lạnh noãn còn được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu  về sinh sản hoặc trong các chương trình ngân hàng noãn. Trong số các kỹ thuật bảo tồn noãn hiện nay, phương pháp thủy tinh hóa (vitrification) đang được ưu tiên lựa chọn do khả năng hạn chế sự hình thành tinh thể băng nội bào, từ đó cải thiện rõ rệt tỷ lệ sống của noãn sau rã đông. Các giao thức thủy tinh hóa noãn thường bao gồm các bước tiếp xúc tuần tự với các nồng độ tăng dần của chất bảo vệ đông lạnh (cryoprotective agents – CPA), khiến quá trình trở nên kéo dài và phức tạp, đặc biệt là trong các môi trường phòng thí nghiệm có khối lượng công việc cao. Nhu cầu ngày càng tăng đối với kỹ thuật thủy tinh hóa trong những năm gần đây, càng làm nổi bật tính cấp thiết của việc tối ưu hóa quy trình. Trong giai đoạn chuẩn bị đông lạnh, các noãn thường phải tiếp xúc với điều kiện không lý tưởng như nhiệt độ phòng, môi trường có độ thẩm thấu cao và nồng độ CPA độc tính cao, từ đó có thể ảnh hưởng bất lợi đến tính toàn vẹn của tế bào. Do đó, việc rút ngắn thời gian tiếp xúc với CPA được kỳ vọng không chỉ giúp cải thiện khả năng sống còn của noãn mà còn góp phần chuẩn hóa và đơn giản hóa quy trình thao tác trong phòng thí nghiệm. Một số nghiên cứu trên mô hình chuột đã chứng minh tiềm năng của phương pháp tiếp xúc đơn với dung dịch thủy tinh hóa (vitrification solution – VS) trong thời gian ngắn khoảng 15 giây. Các nghiên cứu tiếp theo đã mở rộng phương pháp này sang noãn người, tuy nhiên hiệu quả vẫn còn bị giới hạn do tốc độ đông lạnh và rã đông chưa đạt mức tối ưu tại thời điểm nghiên cứu.

Mặc dù thời gian tiếp xúc với dung dịch chất bảo vệ đông lạnh ngắn, một số nghiên cứu đã báo cáo tỷ lệ sống, khả năng thụ tinh và phát triển phôi đạt tiêu chuẩn lâm sàng, qua đó cho thấy noãn người có thể tiếp xúc với thời gian ngắn được các giao thức thủy tinh hóa rút gọn. Gần đây, bằng cách mô phỏng động học thẩm thấu của noãn người, các mô hình tính toán đã dự đoán rằng nguy cơ hình thành tinh thể băng trong bào tương sau 1 phút tiếp xúc với dung dịch cân bằng (equilibration solution – ES) tương đương với nguy cơ dự kiến khi tiếp xúc từ 9 đến 15 phút – khoảng thời gian thường được sử dụng trong các giao thức thủy tinh hóa truyền thống. Các dữ liệu thực nghiệm đã xác nhận dự đoán này, cho thấy tỷ lệ sống sót cao của cả noãn và hợp tử người sau khi tiếp xúc chỉ 1 phút với ES và 1 phút với dung dịch thủy tinh hóa (vitrification solution – VS), khi sử dụng hệ thống thủy tinh hóa dạng hở. Bên cạnh đó, những nỗ lực gần đây nhằm rút ngắn thời gian tái hydrat hóa sau rã đông cũng đã cho thấy kết quả tích cực. Cụ thể, việc giảm thời gian tái hydrat hóa từ 10 phút xuống còn 1 phút ở phôi nang người không làm suy giảm tỷ lệ sống sót hoặc các chỉ số kết cục lâm sàng. Những kết quả tương tự cũng được ghi nhận ở noãn người chưa trưởng thành bị loại bỏ. Tuy nhiên, các nghiên cứu hiện tại về noãn người chủ yếu tập trung vào đánh giá tỷ lệ sống và khả năng tiếp tục quá trình giảm phân sau rã đông, trong khi các chỉ số chức năng quan trọng khác như tỷ lệ thụ tinh và sự phát triển phôi sau sử dụng các giao thức rút gọn vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ.

Mục tiêu: Xác nhận tiền lâm sàng các giao thức thủy tinh hóa và rã đông noãn nhanh bằng cách sử dụng hai mô hình động vật khác nhau (chuột và thỏ).

Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực hiện ở noãn chuột và thỏ được phân bổ ngẫu nhiên vào một trong hai giao thức thủy tinh hóa nhanh (fast vitrification – FV) hoặc chuẩn (standard vitrification - SV), rã đông nhanh (fast warming – FW) hoặc chuẩn (standard warming - SW). Tỷ lệ sống sót và phát triển được đánh giá sau khi rã đông. Tính toàn vẹn của thoi phân bào giảm phân và sự liên kết nhiễm sắc thể được phân tích bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang. Sự phát triển đủ tháng được đánh giá thông qua việc chuyển phôi ở chuột. Mô hình thẩm thấu lý thuyết đã được thực hiện trên noãn người để dự đoán hành vi của chúng trong điều kiện FV, với xác nhận thực nghiệm bằng cách sử dụng noãn người bị loại bỏ.

Kết quả:
Sự tác động của các giao thức thủy tinh hóa khác nhau lên tính toàn vẹn về cấu trúc của thoi phân bào kỳ giữa II (MII) và sự sắp xếp nhiễm sắc thể trong tế bào noãn. Nhóm đối chứng tươi (n=23) và nhóm thủy tinh hóa và rã đông (n=30–34) cho kết quả tương tự với hầu hết các tế bào noãn đều có thoi phân bào hình thành bình thường (97,0– 100%) và nhiễm sắc thể được sắp xếp chính xác (94,1–100%).
Khả năng sống sót và phát triển của noãn chuột MII trải qua các giao thức thủy tinh hóa và rã đông khác nhau cùng với các đối chứng thử nghiệm.

• Tỷ lệ sống sót cao nhất ở giao thức FV/FW (n=249 noãn chiếm 97,2%) cao hơn so với giao thức SV/SW (n=224 noãn chiếm 94,2%) (P=0,008) và so với nhóm SV/FW (n=229 noãn chiếm 91,7%).

• Tỷ lệ hình thành hai tế bào tương tự (P>0,05) (98,4–99,4%) và kết quả tương đương với nhóm đối chứng sử dụng noãn tươi (n=118, 100%).

• Đối với sự hình thành phôi nang, nhóm SV/SW đạt 83,4%, tiếp theo là nhóm FV/FW đạt 80,9% và nhóm SV/FW đạt 75,9%, tất cả đều tương đương với nhóm đối chứng là noãn tươi (n=123) với 86,4%.

• Chất lượng phôi nang không có sự khác biệt giữa nhóm đối chứng (n=49; 130,5 ± 29,1) và nhóm SV/SW (n= 96; 127,3 ± 28,1), SV/FW (n=91; 130,7 ± 30,5) và FV/FW (n=112; 120,7±30,4).

Đối với tỷ lệ làm tổ và phát triển đủ tháng trong noãn chuột, ở nhóm đối chứng sinh 23 con non sống từ 47 phôi nang được chuyển đạt tỷ lệ sinh sống là 48,9%. Nhóm SV/SW, số con non sống cao nhất 44 trong số 92 phôi nang được chuyển, với tỷ lệ sinh sống là 47,8%. Nhóm SV/FW có tỷ lệ sinh con sống là 43,2%, với 41 con non được sinh ra từ 95 phôi nang, trong khi nhóm FV/FW có tỷ lệ sinh con sống là 38,7%, với 36 con non được sinh ra từ 93 phôi nang. Tuy nhiên, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm. Tất cả các con non đều phát triển đến tuổi trưởng thành mà không có bất kỳ vấn đề sức khỏe nào có thể quan sát được hoặc bất thường rõ ràng.
Tỷ lệ sống sót của noãn dao động từ 90% đến 100% và tỷ lệ phát triển phôi trong ống nghiệm sau ICSI không có sự khác biệt đáng kể về mặt thống kê giữa các nhóm.

• Sau khi thụ tinh bằng ICSI, 87% số noãn tươi trong nhóm đối chứng đã phân cắt, trong khi tỷ lệ phát triển hai tế bào trong nhóm thủy tinh hóa là 63,0% đối với nhóm SF/SW, 77,3% đối với nhóm SV/FW và 76,2% đối với nhóm FV/FW.

• Về ​​mặt phát triển phôi nang, nhóm đối chứng có noãn tươi đạt tỷ lệ phát triển là 47,8%. Khi so sánh, nhóm SV/FW cho thấy tỷ lệ thấp hơn đáng kể là 13,6%. Tỷ lệ phát triển phôi nang của nhóm SV/SW và FV/FW lần lượt là 22,2% và 28,6%.

• Tổng số lượng tế bào trung bình trong phôi nang dao động từ 331,7±166,7 đến 356,7±96,5 trong các nhóm này, tương đương với số lượng của nhóm đối chứng là 207,8± 106,3

Trong giao thức SV/SW, quá trình mất nước diễn ra dần qua tiếp xúc với ES trong 12 phút, với sự co nhanh tế bào chất (tối thiểu 61,8% thể tích đẳng trương ở t = 49 giây), sau đó phồng trở lại khi đạt cân bằng thẩm thấu. Khi tiếp xúc với VS trong 1 phút, noãn co mạnh (tối thiểu 50,7%). Trong TS ở 37 °C, thể tích tăng lên 94,3%, sau đó giảm còn 51,4% trong DS, và phục hồi đến 91,9% trong WS. Giai đoạn nuôi cấy dự kiến khôi phục hoàn toàn thể tích đẳng trương. Giao thức SV/FW tương tự đến bước TS, tại đó thể tích đạt 87,0%. Bỏ qua DS và chuyển thẳng sang môi trường nuôi cấy (culture media – CM) gây trương phồng quá mức (118,2%). Ở giao thức FV/FW, noãn tiếp xúc ES đậm đặc trong 1 phút, co nhanh còn 47,4% (t = 28 giây), phục hồi nhẹ (51,9%), sau đó tiếp tục co trong VS (thấp nhất 37,6%), và đạt 41,0% tại thời điểm rã đông. Trong FW tại TS, phục hồi 55,3% sau 11 giây, và đạt 67,1% trong CM sau 1 phút.
Tỷ lệ sống ở noãn MII của người được đánh giá sau 2 và 24 giờ sau khi rã đông. Trong nhóm SV/FW (n=101 noãn), tỷ lệ sống là 97% sau 2 giờ và 94,1% sau 24 giờ sau rã đông. Trong nhóm FV/FW, bao gồm 103 noãn, tỷ lệ sống sót sau 2 giờ là 100% và 97,1% sau 24 giờ sau khi rã đông. Và không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P>0,05) giữa hai giao thức thủy tinh hóa và rã đông.

Kết luận: Nghiên cứu tiền lâm sàng trên nhiều mô hình động vật đã xác nhận rằng các giao thức thủy tinh hóa và rã đông nhanh có khả năng bảo tồn hiệu quả khả năng sống và tiềm năng phát triển của noãn, đồng thời rút ngắn đáng kể thời gian quy trình (thủy tinh hóa từ 12–15 phút xuống 2 phút, rã đông từ 10 phút xuống 1 phút). Các giao thức này giúp tối ưu hóa quy trình IVF, giảm phơi nhiễm với CPA độc hại và điều kiện phi sinh lý. Cả mô hình lý thuyết và dữ liệu thực nghiệm đều hỗ trợ tính khả thi; tuy nhiên, cần các thử nghiệm lâm sàng quy mô lớn và nghiên cứu đa trung tâm để đánh giá hiệu quả lâm sàng và khả năng ứng dụng rộng rãi. Nghiên cứu thêm cũng cần thiết để làm rõ ảnh hưởng đến sự phát triển phôi, đặc biệt ở các giai đoạn khác nhau. Các giao thức nhanh này có tiềm năng cải thiện quá trình bảo quản noãn và kết quả điều trị IVF.

Tài liệu tham khảo: Costa-Borges, N., Matia-Algué, Q., Coello, A., Mestres, E., Acacio, M., Flores-Saiffe Farias, A., ... & Cohen, J. (2025). Preclinical validation of fast oocyte vitrification and warming protocols with comparable efficiencies to a standard method. Human Reproduction, 40(6), 1066-1076.