ThS. Võ Như Thanh Trúc – Chuyên viên phôi học – IVFAS

Giới thiệu
Tình trạng vô sinh, hiếm muộn có thể ảnh hưởng đến khoảng 10 – 15% các cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh sản trên thế giới, và các đối tượng bệnh nhân này cần thiết có sự can thiệp của các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản để có thể đạt được kết quả có trẻ sinh sống. Các kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) hiện nay có thể kể đến như kỹ thuật IVF cổ điển (conventional In Vitro Fertilization) hoặc tiêm trực tiếp tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI – IntraCytoplasmic Sperm Injection). Tuy nhiên, trong số các bệnh nhân điều trị TTTON, vẫn còn một số bệnh nhân thất bại nhiều lần sau nhiều chu kì thực hiện điều trị TTTON. Nhiều yếu tố liên quan đến khả năng sinh sản ở nữ giới, có thể kể đến như quá trình trưởng thành noãn, quá trình thụ tinh và quá trình phát triển phôi đều đóng vai trò ảnh hưởng khá quan trọng đến kết quả điều trị TTTON. Một số nghiên cứu ngoài mô tả các đặc điểm biểu hiện lâm sàng điển hình của các trường hợp vô sinh ở người vợ, còn ghi nhận thêm một số biến thể di truyền đơn gene được cho là có ảnh hưởng đến các quá trình này. Cụ thể hơn, các biến thể di truyền đơn gene có liên quan đến bất thường trưởng thành noãn được báo cáo là TUBB8, PATL2; liên quan đến bất thường thụ tinh là các biến thể trên gene TLE6, WEE2; và các biến thể di truyền gây ra các bất thường ngưng phát triển ở phôi giai đoạn sớm được báo cáo gồm PADI6, NLRP2 và NLRP5.
 
Noãn thoái hoá được ghi nhận thành 4 dạng khác nhau trong quá trình điều trị TTTON: tế bào chất noãn bị co lại, tế bào chất noãn sậm màu (ngả đen sậm), noãn thoái hoá trước khi thực hiện thao tác thụ tinh (IVF cổ điển hay ICSI) và noãn thoái hoá sau thụ tinh. Các kiểu hình noãn thoái hoá này ảnh hưởng đến khả năng thành công của quy trình điều trị IVF/ICSI của bệnh nhân và cũng được coi như một trong những vấn đề gây ra tình trạng vô sinh ở nữ giới. Có báo cáo cho rằng biến thể di truyền trên gene PANX1 có liên quan đến sự hình thành các kiểu hình thoái hoá noãn này. Gene PANX1 mã hoá cho protein kênh xuyên màng tế bào, protein này được glycosyl hoá mức độ cao và được biểu hiện rộng rãi trên nhiều loại mô, cơ quan trên cơ thể người, đặc biệt là ở mô não và noãn người. Chức năng chính của protein PANX1 là hình thành kênh xuyên màng có kích thước lớn nhằm phóng thích ATP (Adenosine Triphosphate) và các sản phẩm biến dưỡng khác, và do đó protein này đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi thông tin giữa các tế bào lân cận với nhau. Vài bằng chứng cho thấy các biến thể đột biến dạng dị hợp trên gene này gây ra các thay đổi trên kiểu mẫu glycosyl hoá của protein, ảnh hưởng đến vi môi trường xung quanh của tế bào và dẫn đến suy giảm chức năng của kênh xuyên màng cấu tạo bởi protein PANX1 cũng như phóng thích ATP ở noãn, gây ra tình trạng noãn thoái hoá. Nghiên cứu của Wang W. và cộng sự (2021) thực hiện một số thí nghiệm nhằm khảo sát ảnh hưởng của các biến thể đồng hợp trên gene PANX1 đến tình trạng thoái hoá của noãn người sau thụ tinh.
 
Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu thực hiện trên 2 gia đình bệnh nhân có tiền sử noãn thoái hoá. DNA được tách chiết từ mẫu máu ngoại vi của người vợ và được thực hiện PCR (Polymerase Chain Reaction) với cặp mồi đặc trưng cho gene PANX1, sau đó tiến hành giải trình tự bằng phương pháp Sanger nhằm xác định tình trạng đồng hợp hoặc dị hợp của biến thể di truyền. Tình trạng mất chức năng của protein này được đánh giá bằng phương pháp glycosylation assay, electrophysiological assay và vi tiêm cRNA vào noãn chuột.
Bên cạnh đó, các thí nghiệm in vitro cũng được thiết kế thực hiện để chứng tỏ các đột biến điểm trên gene PANX1 có thể gây ra các ảnh hưởng đến chức năng của protein này trên dòng tế bào nuôi cấy in vitro. Trình tự toàn gene PANX1 của người được nhân bản và tạo dòng vào vector pCMV6 – Entry. Nghiên cứu thực hiện tạo ra các đột biến điểm định hướng c.712T>C và c.899G>A (các thể đột biến điểm này đã được khẳng định trước đó ở một vài cá thể). Sau khi khẳng định sản phẩm được tạo ra mang các đột biến điểm định hướng, các trình tự này được chuyển nạp vào tế bào HeLa.
 
Tế bào HeLa được thu nhận sau 36h chuyển nhiễm và rửa sạch với dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline) lạnh và tiến hành ly giải thu nhận protein. Protein tổng sau tách chiết được điện di bằng phương pháp SDS – PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyarcrylamide Gel Electrophoresis), sau đó chuyển thẩm sang màng lọc nitrocellulose, chuẩn bị cho phân tích Western blot sau đó, nhằm thu nhận protein PANX1.
 
Kết quả
Kết quả phân tích của các thí nghiệm trong nghiên cứu này xác định các biến thể mang đột biến sai nghĩa ở gene PANX1 dạng đồng hợp c.712T>C và c.899G>A có liên quan đến kiểu hình noãn thoái hoá ở hai gia đình bệnh nhân được tuyển vào nghiên cứu. Cả hai dạng biến thể đồng hợp nói trên đều có thể làm thay đổi kiểu mẫu glycosyl hoá trên protein PANX1 trên các dòng tế bào nuôi cấy in vitro, dẫn đến suy giảm khả năng hoạt hoá kênh xuyên màng cấu tạo bởi protein PANX1, điều này dẫn đến tình trạng noãn thoái hoá sau thụ tinh ở noãn chuột thí nghiệm. Điều đáng chú ý là tác động phá huỷ của hai biến thể đồng hợp lên chức năng protein PANX1 yếu hơn so với tác động gây ra bởi các biến thể ở dạng dị hợp đã được báo cáo trước đây. Kết quả của nghiên cứu này cung cấp cho chúng ta thêm nhiều thông tin, nhằm làm phong phú thêm các dữ liệu về phổ biến thể di truyền của gene PANX1. Điều này làm nổi bật vai trò quan trọng của protein PANX1 đối với sự phát triển của noãn người, giúp chúng ta có thể hiểu rõ hơn về cơ chế di truyền ảnh hưởng đến tình trạng noãn thoái hoá sau thụ tinh trong một số trường hợp thất bại liên tiếp ở các chu kì điều trị TTTON do nguyên nhân này.
 
Nguồn: Wang W, Qu R, Dou Q, Wu F, Wang W, Chen B, Mu J, Zhang Z, Zhao L, Zhou Z, Dong J, Zeng Y, Liu R, Du J, Zhu S, Li Q, He L, Jin L, Wang L, Sang Q. Homozygous variants in PANX1 cause human oocyte death and female infertility. Eur J Hum Genet. 2021 Sep;29(9):1396-1404. doi: 10.1038/s41431-020-00807-4. Epub 2021 Jan 25. PMID: 33495594; PMCID: PMC8440679.

Từ khóa: noãn, thoái hoá, IVF, ICSI, biến thể