CN. Trần Vĩnh Thiên Ngọc – IVFMD Tân Bình

Các gen nằm trên nhiễm sắc thể X chịu trách nhiệm cho ít nhất 250 bệnh di truyền. Do đó, việc xác định giới tính phôi tiền làm tổ có thể ngăn ngừa sự ra đời của những đứa trẻ bị mắc bệnh di truyền liên kết NST X. PGT thường yêu cầu phải sinh thiết các tế bào phôi hoặc thể cực noãn và quy trình sinh thiết là một phương pháp xâm lấn. Các microRNA (miRNA) từ phôi ổn định trong môi trường ngoại bào. Chúng liên kết các protein như Argonaute 2 hoặc được đóng gói thành dạng túi nhỏ gọi là exosome được tiết ra có chọn lọc từ phôi đang phát triển vào môi trường nuôi cấy. Tương tự như miRNA, mRNA được đóng gói thành exosome và được tiết ra từ tế bào vào môi trường ngoại bào. Trình tự RNA nhỏ đã chỉ ra rằng có rất nhiều đoạn mRNA trong môi trường nuôi cấy. Gen SRY là một locus sao chép duy nhất trên nhiễm sắc thể Y của động vật có vú góp phần vào sự hình thành tinh hoàn. SRY có thể được phát hiện ngay cả ở giai đoạn 2 tế bào và phôi nang. Vì SRY được thể hiện ở những giai đoạn đầu này, nó được coi là một dấu ấn sinh học tiềm năng cho việc xác định giới tính phôi tiền làm tổ. Mục đích của nghiên cứu này là kiểm tra một phương pháp không xâm lấn nhằm xác định giới tính phôi tiền làm tổ bằng PCR / RT-PCR với sự hiện diện của axit nucleic SRY trong môi trường nuôi cấy.
 
Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu mù đôi (2020) chia làm 2 nhóm đánh giá: nhóm 1, 40 phôi làm PGT ở phôi D3, nuôi cấy đơn sau khi sinh thiết; nhóm 2, 31 phôi được nuôi cấy đơn đến ngày 5. Nhóm 2 được chia thành ba nhóm nhỏ: tách chiết RNA (RE), axit nucleic (NA) và xử lý DNase (DT). Trong các phân nhóm NA và DT, quá trình tổng hợp cDNA được thực hiện trực tiếp trên môi trường nuôi cấy có hoặc không có xử lý DNase trong các phân nhóm DT và NA tương ứng. Kết quả xác định giới tính dựa trên PCR / RT-PCR trong môi trường nuôi cấy được so sánh với FISH.
 
Kết quả: Trong nhóm 1, tất cả các mẫu được chẩn đoán chính xác. Trong nhóm 2, năm mẫu có giới tính nữ bị chẩn đoán sai. Kiểm tra độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác của thử nghiệm lần lượt là 100%, 94,44% và 96,88% ở RE, 100%, 81,82% và 93,55% ở DT và 100%, 71,43% và 85,71% ở NA. Việc xác định giới tính phôi tiền làm tổ mà không cần sinh thiết phôi, trong môi trường nuôi cấy phôi đã sử dụng phương pháp khuếch đại RNA bao gồm RE và DT có vẻ đáng tin cậy hơn trong khi phương pháp dựa trên axit nucleic (NA) dẫn đến chẩn đoán sai cao nhất có thể do nhiễm DNA.
 
Sinh thiết trong giai đoạn phân chia làm giảm đáng kể tiềm năng làm tổ của phôi. PGT không xâm lấn dựa trên môi trường nuôi cấy phôi đã qua sử dụng, có những ưu điểm như hoàn toàn không xâm lấn, dễ thu mẫu. Trong một số nghiên cứu, hàm lượng DNA ty thể và bộ gen đã được phát hiện trong môi trường nuôi cấy. Về vấn đề này, hơn 99% phôi ngày 2 và ngày 3 có DNA trong môi trường nuôi cấy của chúng, có thể thích hợp cho các nghiên cứu phân tử. DNA từ môi trường nuôi cấy trước đây được sử dụng để chẩn đoán các bệnh liên quan đến NST X, alpha-thalassemia và xơ nang. Trong nghiên cứu hiện tại, nhóm tác giả đã sử dụng RNA và DNA của môi trường nuôi cấy đã sử dụng để kiểm tra phương pháp tiếp cận không xâm lấn để xác định giới tính phôi. Như đã đề cập ở trên,  các tác giả đã kiểm tra hai nhóm, mỗi nhóm chứa ba nhóm nhỏ. Trong nhóm 1, kết quả thu được bằng PCR / RT-PCR cho tất cả 40 mẫu có đã sinh thiết phôi bào để phân biệt giới tính, phù hợp với kết quả thu được của FISH; do đó, tất cả 40 mẫu đã được chẩn đoán chính xác. Ở nhóm 2 (không sinh thiết), nhóm tác giả có thể chẩn đoán chính xác 26 trong số 31 mẫu; tần suất chẩn đoán sai là 1, 2 và 2 mẫu trong các phân nhóm RE, NA và DT. Trong một nghiên cứu được thực hiện bởi Hammond và cộng sự, sự nhiễm DNA có nguồn gốc từ DNA bộ gen và DNA ty thể, được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy phôi. Hai lý do có thể xảy ra cho việc chẩn đoán sai đối với năm mẫu trong thí nghiệm hiện tại là: nhiễm trong quá trình làm việc ở labo và nhiễm từ môi trường nuôi cấy phôi. Vì nghiên cứu sử dụng HSA tái tổ hợp chứ không phải HSA tự nhiên, nên điều thứ hai không thể được coi là nguyên nhân có thể xảy ra. Sử dụng HSA tự nhiên có thể là nguồn ô nhiễm axit nucleic; nghiên cứu đã loại trừ nguồn nhiễm có thể xảy ra này bằng cách sử dụng HSA tái tổ hợp. Rõ ràng, xác suất nhiễm SRY DNA cao hơn nhiều so với SRY RNA. Do đó, chẩn đoán nhầm trong phân nhóm NA dễ xảy ra hơn so với phân nhóm RE và DT. Vì tất cả các chẩn đoán sai đều là mẫu nữ, nên phần lớn có lẽ là do bị nhiễm axit nucleic nam. Do đó, trong dịch vụ lâm sàng bên cạnh các hướng dẫn làm việc với tế bào, việc sử dụng nhân viên nữ cho tất cả các bộ phận của công việc có thể giảm thiểu những chẩn đoán sai như vậy. Như đã đề cập, nghiên cứu tuân theo các hướng dẫn để làm việc với các tế bào cho các mẫu này và sử dụng chứng âm PCR.
 
Có một số hạn chế trong nghiên cứu này bao gồm tỷ lệ phát hiện thấp và khả năng alen dropout. Ngoài ra, nhóm tác giả không chắc có bao nhiêu DNA của môi trường nuôi cấy phôi đại diện cho DNA của phôi vì nó có thể chứa DNA từ huyết thanh của môi trường. Nghiên cứu đã sử dụng mẫu của các bệnh nhân ICSI để giảm nhiễm DNA từ bố mẹ. Một nghiên cứu gần đây đã kết luận rằng cell-free DNA từ phôi người qua môi trường nuôi cấy đại diện cho sự pha trộn giữa DNA của mẹ và phôi. Nhóm tác giả đã tách sạch cumulus để loại trừ nhiễm từ mẹ. Nghiên cứu cũng đã so sánh các phương pháp khác nhau để xem phương pháp nào có độ chính xác chấp nhận được để phân biệt giới tính. Rõ ràng đối với một dịch vụ khám bệnh, chi phí và thời gian cần thiết sẽ là những yếu tố quan trọng. Cả hai phương pháp RE và DT đều có độ chính xác cao hơn phương pháp NA trong khi RE đắt hơn và tốn thời gian hơn. Nghiên cứu này không định lượng lượng RNA chiết xuất được vì không truy cập vào các phần mềm định lượng RNA số lượng rất thấp. Nhóm tác giả giả định rằng các chẩn đoán chính xác hơn trong nhóm được sinh thiết cũng có thể liên quan đến lượng axit nucleic nhiều hơn từ tế bào được hút ra. Tuy nhiên, nhóm tác giả không chắc chắn về số lượng RNA được giải phóng vào môi trường nuôi cấy trong mỗi nhóm. Nghiên cứu đã so sánh kết quả của việc phân biệt giới tính giữa môi trường với kết quả của FISH. Ngày nay aCGH và NGS được sử dụng cho PGT hơn là FISH. Mặc dù FISH có thể dẫn đến chẩn đoán sai, nhưng kết quả gần như đáng tin cậy để xác định giới tính vì sự giải thích dựa trên hai mồi có màu sắc khác nhau cho nhiễm sắc thể giới tính. Cần lưu ý rằng tất cả các kết quả trái ngược nhau đều nằm ở nhóm thứ hai mà nghiên cứu đã tiếp cận với toàn bộ phôi ngày 5 để FISH định hình và phân tích và điều này làm cho chẩn đoán giới tính của FISH trở nên đáng tin cậy.
 
Ở người, xác định giới tính trước khi chuyển phôi có tiềm năng có lợi trong việc ngăn ngừa lây truyền các bệnh di truyền liên quan đến giới tính như chứng loạn dưỡng cơ Duchenne, hội chứng Lesch-Nyhan và bệnh máu khó đông. Hơn 200 bệnh đột biến lặn liên kết NST X ảnh hưởng đến nam giới dị hợp tử, có thể dễ dàng kiểm soát bằng cách lựa chọn giới tính. Các nghiên cứu trước đây đã xác định được sự biểu hiện của SRY mRNA trong các phôi người tiền làm tổ; nghiên cứu này đã kiểm tra hướng tiếp cận không xâm lấn để xác định giới tính của phôi tiền làm tổ bằng RT-PCR đối với gen SRY trên môi trường nuôi cấy đã qua sử dụng. Bằng cách sử dụng kỹ thuật RT-PCR, nhóm tác giả đã quan sát thấy sự hiện diện của các sản phẩn dịch mã gen SRY trong môi trường nuôi cấy.
 
Tóm lại, giới tính của phôi tiền làm tổ có thể được xác định bằng kỹ thuật RT-PCR và so sánh kết quả với kết quả thu được của FISH. Đối với nhóm 1, bao gồm môi trường nuôi cấy phôi đã được sinh thiết vào ngày 3, có kết quả chẩn đoán chính xác 100%. Đối với nhóm 2, không có sinh thiết ngày 3, kết quả chẩn đoán không đúng hoàn toàn. Mặc dù tuân theo các hướng dẫn để làm việc với các tế bào đơn, chẩn đoán sai có thể là do nhiễm axit nucleic trong quá trình làm việc trong phòng thí nghiệm thay vì môi trường nuôi cấy vì sử dụng HSA tái tổ hợp. Kết quả của nghiên cứu này đề xuất một phương pháp mới không xâm lấn mới dựa trên môi trường nuôi cấy để xác định giới tính phôi. Các phương pháp dựa trên khuếch đại RNA bao gồm tách chiết RNA (RE) và xử lý DNase (DT) đáng tin cậy hơn trong khi phương pháp dựa trên axit nucleic (NA) dẫn đến chẩn đoán sai cao nhất có thể do nhiễm DNA. Vì tất cả các mẫu phôi giới tính nam được chẩn đoán chính xác trong tất cả các nhóm nhỏ của nghiên cứu sơ bộ này, việc xác định giới tính không xâm lấn tiền làm tổ trên môi trường nuôi cấy có vẻ khả thi, tuy nhiên tất cả các nguồn gây nhiễm axit nucleic phải được hạn chế tối đa.
  
Nguồn: Esmaeili M, Bazrgar M, Gourabi H, Ebrahimi B, Boroujeni PB, Fakhri M. Noninvasive sexing of human preimplantation embryos using RT-PCR in the spent culture media: a proof-of-concept study. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 2020 Sep 1;252:89-93.

Từ khóa: Xác định giới tính phôi người không xâm lấn bằng cách sử dụng RT-PCR cho môi trường đã nuôi cấy phôi: một nghiên cứu chứng minh tính khả thi của ý tưởng