CNSH. Trần Nhật Ánh Dương – IVFMD Tân Bình

Tế bào noãn trưởng thành là một trong những yếu tố then chốt để có thể mang thai thành công. Trong suốt quá trình hình thành và phát triển, noãn sẽ trải qua hai giai đoạn nghỉ là khi noãn sơ cấp bước vào pha diplotene của kỳ trước giảm phân I, lúc này các nhiễm sắc thể (NST) được bao quanh bởi một lớp màng, hình thành nên cấu trúc gọi là túi mầm (germinal vesicle – GV). Dưới sự kích thích của sự gia tăng LH, tế bào noãn tiếp tục quá trình giảm phân, được đặc trưng bởi sự phân hủy GV để giải phóng NST vào bào tương noãn. Và giai đoạn nghỉ thứ 2 xảy ra vài giờ sau đỉnh LH, ở kỳ giữa của giảm phân II tạo thành noãn trưởng thành (Metaphase II-MII). Noãn MII chỉ vượt qua giai đoạn nghỉ khi có sự thụ tinh với tinh trùng.

Gần đây, các đột biến gen đã được chứng minh là nguyên nhân gây nên sự sai sót trong quá trình trưởng thành của noãn, khiến cho noãn không vượt qua được giai đoạn nghỉ để trưởng thành. Mặc dù một số đột biến gen đã được xác định là nguyên nhân gây ra sự ngăn cản noãn trưởng thành như TUBB8, PATL2 và TRIP13 (Feng và cộng sự., 2016; Chen và cộng sự, 2017; Zhang và cộng sự, 2020) nhưng các đột biến trên chỉ chiếm không quá 30% kiểu hình, và các nguyên nhân gây ra sai sót trong quá trình trưởng thành noãn của phần lớn bệnh nhân vẫn chưa được làm sáng tỏ.

Vì vậy, Ping Yang và cộng sự (2021) đã thực hiện nghiên cứu này nhằm tìm hiểu thêm về những nguyên nhân di truyền gây ra các sai sót trong quá trình trưởng thành của tế bào noãn.

THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU:
Nghiên cứu này được tiến hành trên những bệnh nhân từ 2 gia đình độc lập được chẩn đoán vô sinh nguyên phát, đặc trưng chủ yếu là các sai sót trong quá trình trưởng thành của noãn dẫn đến việc thu nhận được rất ít hoặc không thu nhận được noãn MII trong các chu kỳ điều trị IVF/ICSI. Bằng cách thu nhận DNA bộ gen từ máu ngoại vi và giải trình tự toàn bộ exome (Whole-exome sequencing-WES) và giải trình tự Sanger để xác định các đột biến. Khả năng gây bệnh của các đột biến đã được dự đoán trong phân tích silico. Thử nghiệm minigene và giải trình tự RNA đơn bào được thực hiện để đánh giá ảnh hưởng của đột biến này lên tính toàn vẹn của mRNA và phiên mã của noãn bào.

KẾT QUẢ:
Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân
Bốn bệnh nhân từ 2 gia đình đều có những đặc điểm chung như được chẩn đoán là vô sinh nguyên phát không rõ nguyên nhân trong nhiều năm liền. Những bệnh nhân này đều có mức hormone cơ bản gần như bình thường ngoại trừ mức FSH cơ bản tăng cao, và nồng độ  hormone AMH (Anti-Mullerian Hormone) trong mức giới hạn bình thường. Cả 4 bệnh nhân đều bị thất bại nhiều lần trong các chu kỳ điều trị IVF trước đó do chỉ thu nhận được noãn GV hoặc noãn chưa trưởng thành (metaphase I- MI), có rất ít hoặc hầu như không thu nhận được noãn MII sau chu kỳ kích thích buồng trứng.

Xác định biến thể gây bệnh trong gen TATA-box binding protein like 2 (TBPL2)
TATA-box binding protein like 2, còn được gọi là protein liên kết TATA 2 (TBP2) hoặc nhân tố liên quan đến TBP 3 (TBP-related factor 3-TRF3), là một gen đặc trưng cho tế bào noãn của động vật có xương sống (Xiao et al., 2006; Gazdag et al., 2007). TBPL2, là một thành viên của họ TBP, gồm 2 vùng: N-terminal domain và C-terminal chứa vị trí liên kết DNA, có độ tương đồng cao với TBP (Bartfai và cộng sự, 2004; Akhtar và Veenstra, 2011). TBP2 có thể liên kết với đoạn TATA, tương tác với TFIIA và TFIIB, và làm trung gian cho sự khởi đầu phiên mã RNA polymerase II (Pol II). TBP2 là một yếu tố phiên mã chung đặc hiệu cho tế bào động vật có xương sống (Jacobi và cộng sự, 2007). Một nghiên cứu trước đây trên chuột cho thấy rằng TBPL2 liên kết với các gen hoạt động trong tế bào noãn và điều hoà sự biểu hiện của chúng (Gazdag và cộng sự, 2009). Chuột cái thiếu TBP2 bị vô sinh do khiếm khuyết trong quá trình tạo nang noãn, sự hình thành NST và giảm các yếu tố điều hòa của các gen quan trọng trong tế bào noãn, chẳng hạn như Gdf9 và Bmp15 (Gazdag và cộng sự, 2009). TBP2 đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển của tế bào mầm sinh dục của động vật có vú.

Bằng cách giải trình tự toàn bộ exome ở các thành viên ở 2 gia đình phát hiện một đột biến đồng hợp tử (c.788 + 3A> G, p. R233X) tại vị trí nối của TBPL2. Giải trình tự Sanger đã xác minh rằng đây là loại đột biến gen lặn trên NST thường. Phân tích Haplotype chỉ ra rằng nguồn gốc alen gây bệnh cả 2 gia đình là độc lập. Ngoài ra, đột biến này không được tìm thấy trong nhóm đối chứng. Đột biến được xác định nằm trong vùng C-terminal của gen TBPL2. Tin sinh học dự đoán rằng đột biến này có thể gây ảnh hưởng đến quá trình cắt nối mRNA. Vị trí của đột biến này được bảo tồn giữa các loài khác nhau.

Biến thể TBPL2 làm suy giảm tính toàn vẹn của mRNA:  
Để điều tra ảnh hưởng của biến thể đối với tính toàn vẹn của mRNA in vitro, một thử nghiệm minigene đã được thực hiện ở hai dòng tế bào khác nhau, là tế bào 293T và tế bào Hela. Trong cả tế bào 293T và tế bào Hela đều cho ra sản phẩm RT-PCR của vectơ đột biến ngắn hơn so với nhóm đối chứng. Phân tích trình tự cho thấy rằng đột biến này đã bỏ qua exon 4 và dẫn đến kết thúc sớm, khiến cho việc sản xuất protein bị cắt ngắn đi 232 axit amin.

Để đánh giá thêm ảnh hưởng của đột biến đối với việc cắt nối mRNA in vivo, nhóm tác giả đã tiến hành giải trình tự TBPL2, cDNA từ tế bào noãn chưa trưởng thành. Kết quả giải trình tự cho thấy rằng đột biến đã xoá bỏ hoàn toàn Exon 4 trên mRNA, phù hợp với kết quả ở thử nghiệm in vitro. Do đó, biến thể (c.788+3A>G) trong gen TBPL2 làm cho protein bị cắt ngắn dẫn đến thiếu phần lớn vùng lõi.

Biến thể TBPL2 gây ra sự thay đổi biểu hiện của các gen đặc trưng cho tế bào noãn
Để nghiên cứu những ảnh hưởng của đột biến gen TBPL 2 lên quá trình phiên mã ở tế bào noãn, nhóm tác giả đã thu nhận 2 noãn MI từ bệnh nhân trong gia đình 1 và 3 noãn MI trong nhóm đối chứng để xác định trình tự RNA. Kết quả cho thấy có tổng cộng 2065 gen bị ảnh hưởng bởi đột biến này. Số lượng gen ức chế cao hơn đáng kể so với số lượng gen kích thích. Các gen ức chế bao gồm BMP15, GDF9 và zona pellucida glycoprotein 1 (ZP1). Các gen đặc trưng cho tế bào noãn quan trọng đối với sự hình thành nang noãn (bao gồm quá trình tạo noãn và trưởng thành noãn), thụ tinh và phát triển phôi như BMP15, GDF9, ZP1, ZP4, TLE, TLE6,... đều bị ức chế làm giảm đáng kể.

Phân tích GO (Gene Ontology) của các quá trình sinh học cho thấy rằng các gen liên quan đến RNA telomerase, tổng hợp protein và quan trọng là nhiều gen liên quan đến giảm phân, hình thành NST và thoi vô sắc cũng bị ức chế làm giảm đáng kể. Phân tích thành phần tế bào cho thấy rằng các gen liên quan đến các thành phần trung thể và vi ống cũng bị ức chế giảm biểu hiện rõ rệt. Phân tích KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) cho thấy số lượng các gen ức chế tăng mạnh trong quá trình chuyển hóa protein, biến đổi protein và quá trình phiên mã RNA.

KẾT LUẬN:
Như vậy nghiên cứu này đã phát hiện ra một đột biến đồng hợp tử mới ở gen TBPL2 làm giảm sự biểu hiện của các gen cần thiết cho sự phát triển tế bào noãn và dẫn đến vô sinh ở nữ giới, đặc trưng bởi các khiếm khuyết trong quá trình trưởng thành của noãn. Phát hiện này đã làm phong phú thêm phổ gen chịu trách nhiệm cho những sai sót trong noãn và phôi sớm, đồng thời sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc chẩn đoán di truyền ở những bệnh nhân vô sinh sau nhiều lần thụ tinh ống nghiệm thất bại, tạo cơ sở cho việc tư vấn di truyền.

Nguồn: Ping Yang, Tailai Chen, Keliang Wu, Zhenzhen Hou, Yang Zou, Mei Li, XinZe Zhang, Junting Xu, Han Zhao, A homozygous variant in TBPL2 was identified in women with oocyte maturation defects and infertility, Human Reproduction, 2021.

Từ khóa: Một đột biến đồng hợp tử trong gen TBPL2 được tìm thấy ở những phụ nữ bị khiếm khuyết trong quá trình trưởng thành noãn và vô sinh